超过10,000名中国患者的泛癌ctDNA检测
文献概述
背景：尽管近年来发表了许多与ctDNA相关的研究，但仍然缺乏对不同癌症类型的ctDNA的大规模分析。
方法：采用靶向深度测序分析，并提供研究血浆cfDNA中肿瘤来源的基因组改变所需的深度和广度。为了消除克隆性造血（CH）相关变异的干扰，还对白细胞（WBC）DNA进行了平行测序，并与cfDNA进行了比较，以识别肿瘤特异性基因组改变。此外使用ctDNA量化肿瘤内异质性和克隆性，并探索泛癌患者对靶向治疗敏感标志物。
结果及结论：使用血浆和白细胞之间的平行测序，14%的浆细胞游离DNA样品包含CH变异，其可检测性随着年龄的增长而增加（在另外一个超深度60000X的文章中显示有53%左右CH变异）。消除CH变异后，在73.5%的血浆样本中检测到ctDNA，其中小细胞肺癌（91.1%）和前列腺癌（87.9%）的可检测性最高。ctDNA分析揭示的驱动基因频率与基于组织的数据库中相似（R2=0.87，p<0.001）， 但也有一些差异，例如非小细胞肺癌中较高的EGFR（44.8% vs 25.2%） 和较低的KRAS频率（6.8% vs 27.2%），以及较高的肝癌TP53（53.1% vs 28.6%）。高达41.2%的血浆样本具有药物敏感性改变。
文献内容
1.分析队列的描述
分析总共包括来自11,525名患者的13,333份血液样本。
该队列包括41种主要肿瘤类型。最常见的肿瘤类型是非小细胞肺癌（NSCLC;n=5548），组织学未知肺癌的肺癌样本（HUK，n=1668）。其他常见类型包括结直肠癌（n=1195）、乳腺癌（n=1178）、上消化道癌（UGI）（n=575）和肝细胞癌 （HCC;n=571）。超过一半的样本来自转移期患者（临床IV期，7303/13,333,54.8%）。
cfDNA的平均提取浓度为31.9 ng/ml（1.05–396.0ng/ml），癌症类型之间没有明显差异。对所有血浆样品进行深度覆盖测序（中位数4429×；1000–30,368×），以确保检测基因组改变的高灵敏度。WBC的中位测序深度为423×（369–7279×）。
2.一些cfDNA突变来源于WBC中的CH变异
在cfDNA中追踪了在WBC中鉴定的CH变异，其中突出显示了1861个血浆样本中的2754个突变（14.0%），与CH相关的15个经典基因，包括DNMT3A、TP53、TET2和PPM1D，是最反复出现的。
在>20%的黑色素瘤、膀胱癌、子宫癌和前列腺癌血浆样本中检测到CH变异，在<10%的肾癌和甲状腺癌样本中检测到CH变异。检测最多的CH基因因癌症类型而异。例如，TP53是黑色素瘤和SCLC中最常见的CH基因，而DNMT3A在子宫癌和宫颈癌中最常见。cfDNA中CH突变的AF分布大多数在0%到10%之间。CH突变在cfDNA中表现出的AFs显著低于非CH突变。
尽管这种突变过滤策略在很大程度上避免了cfDNA中低AF改变的干扰，但WBC的有限测序深度引起了人们的担忧，即一些CH改变可能会逃避WBC筛选，从而使整体cfDNA结果产生偏差。
为了解决这个问题并阐明cfDNA中体细胞突变的生物学来源，从1291名患者收集了成对的肿瘤组织样本，并进行了相同的测序程序。组织样本的中位测序深度为1808×（487–5525×）。在来自同一患者的血浆cfDNA中，在976个样本中检测到4500个体细胞突变（75.6%）。绝大多数被WBC过滤的cfDNA体细胞突变（96.2%，4032/4193）可以在匹配的肿瘤组织中得到验证。在WBC匹配筛选后，CH变异似乎仍然存在一小部分。
3.ctDNA的可检测性和分子特征因癌症类型而异
消除CH变异后，在9801份血浆样本中检测到51,133个非同义突变、1945个拷贝数变异 和442个重排。
ctDNA检测的总体灵敏度为73.5%。ctDNA的可检测性因癌症类型而异。
大多数IV期样本（79.7%， 5817/7303）具有可检测到的改变，而较小比例的I-III期样本（57.9%， 879/1519）具有可检测到的改变。在IV期疾病中，除肾癌（63.2%）和黑色素瘤（68.2%）外，大多数癌症类型的>70%的样本中检测到ctDNA。
ctDNA的最大AF代表了cfDNA分子总体中肿瘤来源的ctDNA分子的相对定量，与肿瘤质量的细胞数量相关，可用于确定肿瘤负荷。ctDNA AF在不同的癌症类型和同一癌症类型的不同样本中差异很大，SCLC表现出较高的AF。
SCLC显示高血瘤突变负荷（bTMB），子宫癌、膀胱癌、结直肠癌和宫颈癌的bTMB也高于其他癌症类型。
ctDNA脱落可能会影响循环肿瘤负荷的确定。基于bTMB的75%百分位数，高和低bTMB的临界值设置为8.7个突变/Mb。超过一半的SCLC样品被认为是高bTMB。
此外，bTMB与ctDNA AF呈正相关（R2=0.106，0.1也叫正相关了…样本量大导致的？），当根据ctDNA AF将样本分成不同组时，观察到bTMB呈阶梯状增加。表明AF校正的bTMB可能是一种更好的治疗标志物。
4.泛癌种ctDNA的突变景观
MSKCC数据集，使用了涵盖468个基因的特异性测序panel。纳入了60多种癌症类型和10,000名晚期癌症患者
一半的血浆样本（50.5%）携带TP53突变，在宫颈癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌和黑色素瘤中，TP53突变的频率为<20%。不同癌症类型的其他常见突变基因符合预期。例如，EGFR突变发生在44.2%的NSCLC样本中，RB1突变发生在63.4%的SCLC样本中。除TP53外，APC（44.4%）、KRAS（33.8%）和PIK3CA（11.2%）是结直肠癌样本中最常见的突变基因。TERT启动子SNV（22.3%）常见于HCC样本中。胰腺癌样本表现出高频的KRAS（62.8%）和CDKN2A（17.2%）突变。此外，39.1%的乳腺癌样本携带PIK3CA突变。值得注意的是，DNMT3A突变（其中相当一部分被过滤掉为CH变异）通常发生在所有癌症类型中，但在MSKCC中不存在。这表明应进行除WBC过滤以外的其他技术，以进一步消除CH变异的干扰。
ctDNA分析中最常见的20个基因
为了评估基于ctDNA的液体活检和组织活检之间的基因组一致性，对驱动基因的频率进行了相关性分析，结果显示很强的线性关系。尽管总体上是一致的，但该文章的统计的ctDNA队列和MSKCC的突变景观之间仍然存在一些差异。进一步将top突变基因的频率与MSKCC中的频率进行了比较；为了避免样本量引起的差异，只有那些具有统计学显著差异和>50%倍变化的基因被鉴定为差异基因并标记为红色星号，柱状图和绿色三角形分别表示ctDNA队列和MSKCC中突变基因的频率。
EGFR突变在NSCLC血浆样本中比在MSKCC中更常见（44.8%对25.2%），热点分布存在一些差异。例如，血浆样本中外显子19缺失（e19del）和T790M的频率较高，而介导对第三代EGFR抑制剂的耐药性的C797S仅存在于血浆样本中。
在NSCLC血浆样本中观察到的KRAS突变频率低于MSKCC（6.8%对27.2%）。前列腺癌血浆样本中观察到AR突变的频率很高。所有这些突变位点都位于配体结合域，与对雄激素剥夺疗法的耐药性有关。这些发现强调了ctDNA在揭示耐药机制方面的优势，并突出了血浆和组织活检之间的相似之处和差异。
为了探索ctDNA变体的功能意义，通过为每个通路分配特定基因来评估与增殖潜力相关的 10 个经典信号通路（即细胞周期、Hippo、Myc、Notch、Nrf2、PI3K、RTK/RAS/MAPK、TGFβ、p53 和 Wnt）。RTK-RAS通路的改变频率最高（占样本的 56.1%），其次是p53（占样本的 53.9%）和PI3K（占样本的 22.8%）通路。
进一步研究了不同途径之间改变的相互排他性和共现性。最突出的特点是RTK-RAS通路与其他通路之间没有共存，并且发现RTK-RAS和p53/PI3K通路之间存在轻微的相互排他性，表明RTK-RAS通路的改变可以单独诱导肿瘤发生。在p53和细胞周期通路之间发现最强的共现，这些结果说明了不同途径之间的串扰，揭示了可以在治疗上探索的功能相互作用和依赖性。
5.通过ctDNA分析重建肿瘤克隆结构
MATH算法反映的ctDNA的高异质性意味着其复杂的克隆结构。考虑到大多数样本来自正在接受治疗的晚期疾病患者，ctDNA的丰度使基因组克隆性的重建成为可能。采用一种使用标准化AF量化突变克隆性的方法，并探索了它们在不同癌症类型和特定驱动基因中的分布。
在整个血浆队列中，突变克隆性分布几乎是双峰的，两个最大值通常分别为>0.9和<0.1（常见驱动基因 （即TP53、EGFR、PIK3CA、KRAS、APC、RB1、NF1、ERBB2和BRAF） 的百分比在克隆性 ≥0.9 的亚组中为 47.1%，但在克隆性 <0.1 的亚组中逐渐下降至 9.5%。
TP53是样本中最普遍的突变基因，在不同癌症类型中的平均克隆性为>0.5，胸腺癌和子宫癌的值很高。EGFR突变在NSCLC中的克隆性很高。这些结果与文献报道一致，并表明ctDNA定向克隆性分析是确定肿瘤克隆结构的有利替代方案。
6.通过ctDNA分析揭示治疗可作性
基于ctDNA的液体活检最有意义的应用之一是寻找药物敏感标志物并确定靶向治疗继续进展患者的耐药机制。
从3306个样本（41.2%）中全球检测到4665个潜在的药物敏感靶点，其中2299个样本（28.6%）1级靶点，100个样本（1.2%）2A级靶点，221个（2.8%）2B级靶点，226个（2.8%）3A级靶点， 459个（5.7%）3B级。
超过一半的NSCLC（55.8%， 2258/4050） 、 GIST（54.5%， 12/22）和乳腺癌（52.7%， 443/840）样本表现出治疗标志物。
总共检测到63种药物敏感标志物，其中最常见的是EGFR e19del。多达17种癌症类型中检测到PIK3CA突变。在NSCLC中，显性突变为EGFR e19del和L858R，T790M的克隆性低于e19del和L858R。这表明使用 I 代和 II 代酪氨酸激酶抑制剂的患者获得性耐药的进化轨迹。
根据ctDNA分析，成功完成了137例接受靶向治疗的患者的临床随访，其中包括114例 NSCLC、17例乳腺癌和6例结直肠癌患者。AF与患者PFS呈中度负相关。
≤0.01 AF患者的mPFS（12.8个月）显著长于>0.01 AF 的患者（5.8 个月）。表明 ctDNA可以帮助预测治疗预后。
总结
- 这是一项针对泛癌中国患者的无创ctDNA检测研究。开发了一种平行测序过程来识别CH相关变异，ctDNA的敏感性，并描述了不同癌症类型的波动水平和bTMB分布。发现ctDNA的基因组景观与组织测序数据的基因组景观不同。此外通过液体活检重建了肿瘤克隆结构，并突出了具有临床可作性的基因组改变，这有助于衡量未来治疗开发线的潜在价值。
- 在这项研究中，ctDNA对局部或区域疾病的敏感性为57.9%。虽然这还远非理想，但这优于常见蛋白质生物标志物的灵敏度。