单细胞揭示免疫激活的肿瘤微环境与晚期HCC对atezolizumab+贝伐的临床反应相关

文献概述

背景：尽管atezolizumab加贝伐是晚期肝细胞癌（HCC）的标准治疗方法，但很大一部分患者并未获得持久获益。本研究旨在通过研究免疫激活在肿瘤微环境（TME）中的作用来确定这种疗法的预测性生物标志物。

方法：在12例患者的治疗前肿瘤活检中使用单细胞转录组学表征了接受atezolizumab联合贝伐珠单抗治疗的晚期HCC患者的瘤内TME。后将单细胞数据与来自独立临床试验队列的公开bulk-RNA测序数据整合。

结果及结论：对atezolizumab加贝伐珠单抗联合治疗有反应的患者表现出免疫激活的TME，其特征是细胞毒性增强和肿瘤特异性T细胞反应。这些患者还表现出富含炎性细胞因子的肿瘤相关巨噬细胞簇比例增加，与T细胞的相互作用更强，树突状细胞的数量增加，肿瘤内皮细胞中的抗原呈递功能被激活。这些免疫激活特征与无进展生存期的改善相关。

数据详情

单细胞转录组学数据：对17例患者进行了治疗前穿刺活检。对于一名接受了手术切除但随后发生肺转移的患者，收集了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）进行分析。10x Genomics，筛选掉表达少于300个基因的细胞和来自线粒体基因表达细胞的>20%唯一分子标识符（UMI）标签的细胞。

bulk-RNAseq：整合了来自GO30140 Ib期和IMbrave150 III期临床试验的公开数据，原始fastq数据（EGAD00001008128）和相应的临床数据（EGAD00001008130）来自欧洲基因组表型组档案

文献内容

1.晚期肝细胞癌中10种主要细胞类型的分析

为了描绘晚期HCC的单细胞景观，使用10x Genomics平台通过scRNA-seq分析了18份组织样本，包括17份肿瘤活检和1份TIL样本。12例患者接受一线atezolizumab联合贝伐治疗。除了2名患者外，这些患者都是初治患者。

总共分析了63,936个高质量细胞，10个细胞类型：C1髓系细胞（PTPRC和CD68）；C2浆细胞样树突状细胞（DC;CLEC4C和CD74）；C3 B细胞（PTPRC、CD79A和MS4A1）;C4浆细胞（CD79A和MZB1）;C5 T/NK细胞（PTPRC、CD3D、CD4、CD8A和KLRF1）；C6成纤维细胞（ACTA2和COL1A1）；C7 内皮细胞 （FCN3、PECAM1和VWF）；C8恶性肝细胞（HP 和KRT7）；C9肥大细胞（KIT）；和C10循环细胞（STMN1和MKI67）。

对12例接受atezolizumab联合贝伐珠单抗治疗的患者进行了转录组学分析。根据mRECIST标准，患者被分类为反应者（PR，n=4）或无反应者（SD/PD，n=8）。总缓解率为33.3%，SD为25.0%，PD为41.7%。在应答者和无应答者之间的主要细胞类型比例上未观察到显著差异。

应答者的免疫细胞往往更高。

2.atezolizumab+贝伐反应者中细胞毒性和组织驻留T细胞特征丰富

27,717个T或NK细胞，分为14群包括5个CD4T细胞亚群、4个CD8T细胞亚群、2个γδT细胞亚群、1个粘膜相关不变T细胞亚群和2个NK细胞亚群。

还进行了scTCR-seq以评估T细胞多样性和克隆性，产生了41,884个TCR序列，与T细胞匹配度为90%。

反应组CD8T细胞（C6-C9簇）内的克隆性评分（基尼指数）增加，尽管由于样本量小，这没有达到统计学意义。

CD8+T细胞簇中，描绘了不同的亚群，包括表达IL7R（C6）的中央记忆T细胞、表达CCL4（C7）、表达GZMK和耗竭标志物的Tem细胞，如PDCD1、ICOS和HAVCR2（C8），以及表达GZMH（C9）。

应答者的CD4_Tcm_IL7R+（C2）和CD8_Tcm_IL7R+（C6）显著低于无应答者。

在CD8+T细胞群内差异分析探索应答者和非应答者之间的差异。与无反应者相比，应答者表现出更高的耗竭分子（如PDCD1、ICOS和HAVCR2）和细胞毒性分子（如FGFBP2、GNLY和GZMB）的表达。

GSEA显示应答者中细胞毒性相关通路的T细胞激活、组织驻留T细胞的丰度以及反应组中肿瘤特异性特征的富集。

反应者在CD8+T细胞中的细胞毒性和耗竭评分显著更高。

3.促炎性TAM_activating_CCL+簇增强T细胞募集并预测对 atezolizumab加贝伐珠单抗的反应

髓系细胞包含两个不同的C1Q+TAM簇。静息TAM（C1）表达C1Q基因（C1QA，C1QB，和C1QC）和GPNMB，而激活的TAM簇（C2）显示促炎趋化因子表达 （CCL3，CCL4和CXCL2） 以及C1Q基因。

其他簇包括表达EREG、FCN1和S100A4的MDSC-like_EREG+细胞（C3）和具有高中性粒细胞标志物表达（CSF3R、G0S2和NAMPT）的Neutrophil_CSF3R+细胞（C4）。C1和C2都表达吞噬相关基因（MRC1、CD163、MERTK和C1QB），C2显示出明显更高的M1相关特征。

反应组在C2中的比例较高，而无反应组在C1和Neutrophil_CSF3R+亚群中的比例较高。应答者还显示促炎介质的表达显著升高，包括趋化因子CCL3、CCL4、细胞因子IL1B和转录调节因子KLF2。C2中免疫募集通路激活。CCL3-CCR5是髓系细胞和T细胞之间的关键配体-受体对，在反应者中观察到更强的相互作用。

独立队列（GO30140+IMbrave150，n=217）中的CCL3表达分析进一步支持了这一点，CCL3与CD8+T细胞标志物和细胞毒性T细胞相关性比无反应者强。

mIF分析表明，应答者在CD163+和CCL3+细胞之间表现出高度的共定位，而这种共存在无应答者中显著减少。反应者中CD163+CCL3+ TAM的数量显著高于无反应者，并且与PFS具有很强的相关性。

4.cDC2_CD1C+树突状细胞富含应答基因

4个DC亚群：（1）表达 cDC1_CLEC9A+的标志物，如IDO1、XCR1和CLEC9A;（2）表达CD1C、CLEC10A和FCER1A的cDC2_CD1C+;（3）mDC_LAMP3+代表迁移的DC并表达CCR7、BIRC3和LAMP3等标志物;（4）表达标志物IRF7和LILRA4的浆细胞样DC（pDC）。反应者中cDC2_CD1C+的比例高于无反应者。

5.肿瘤相关内皮细胞在反应者中表现出增强的抗原呈递

1360个内皮细胞：两个正常的内皮簇：Endothelial_PROX1+（TFF3 和 PROX1）和肝窦内皮细胞（LSEC，表达 CLEC4G），以及代表肿瘤相关内皮细胞（TEC，表达VWF 、 PLVAP和PECAM1）。

抗原呈递途径在应答组中富集，对抗原呈递至关重要的基因高表达，例如CD74、HLA-DRA、B2M和HLAC。无反应者表现出与细胞投射相关的通路富集（EMP1、ICAM1、 SEPTIN2和TLN1），包括组装、组织和调节等过程。血管生成途径也富集于无反应者中（CD40、HSPG2、RAMP2和TGFBR3）。

6.整合bulk-RNAseq揭示激活的TME相关基因特征，用于预测HCC对 atezolizumab加贝伐的反应

使用来自217例治疗前肿瘤活检（GO30140+IMbrave150）的转录组数据计算了细胞毒性、耗竭、活化TAM和cDC2评分，并评估了与PFS和OS的关联。细胞毒性或耗竭评分高或高活化TAM和DC评分高的患者（前50个百分位数）在atezolizumab联合贝伐珠单抗治疗下PFS显著更长。

这些特征不能预测索拉非尼治疗患者的PFS。

对于OS，只有细胞毒性T细胞特征与该指标显著相关。

基于上述发现开发了一个10基因atezolizumab加贝伐珠单抗反应特征（sc_ABRS），包括细胞毒性/耗竭的T细胞、活化的TAM和cDC2细胞。

sc_ABRS与PFS相关，但与OS无关。PFS的AUC为0.75，sc_ABRS的表现与已建立的生物标志物相当，例如CD274（AUC=0.72）、有效T细胞特征（AUC=0.76）和atezolizumab+贝伐珠单抗反应特征（AUC=0.76）。

总结

• 在对晚期HCC免疫景观的全面单细胞分析中，确定了与良好结果相关的免疫细胞群和分子特征，特别是以肿瘤特异性细胞毒性 T 细胞、富含细胞因子的TAM、cDC2细胞增加和TEC抗原呈递增强为特征的活化 TME。
• 与GO30140和IMbrave150试验的先前结果一致，与无反应者相比，对 atezolizumab-bevacizumab的反应者表现出更高水平的耗竭和细胞毒性基因特征。