ICLR｜无需参考数据库，LLM智能体实现单细胞转录组自动注释

单细胞和空间转录组学技术为解析细胞异质性提供了重要工具，但细胞类型注释作为其核心分析步骤，传统上依赖人工比对基因标记和参考数据，过程耗时且对领域知识要求较高。

近期，一项标题为《Reference-free cell-type annotation with LLM agents》（ICLR 2025）的研究提出了一种基于大型语言模型（LLM）智能体的无参考注释方法。该方法通过高层次目标指令驱动LLM自主规划分析流程、执行代码并输出结果，无需依赖预设参考数据库。实验表明，Claude 3.5 Sonnet和o3-mini在准确性和稳定性上接近专家水平，而GPT-4o因标签粒度较粗及幻觉问题表现较弱。

背景：细胞类型注释的挑战与LLM的潜力

单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术能够捕捉组织中单个细胞的基因表达谱，从而揭示细胞异质性。然而，确定每个细胞簇的生物学身份（即细胞类型）仍是一项挑战。

传统方法依赖以下步骤：首先基于转录相似性（如使用Seurat或Scanpy进行聚类），然后通过人工筛选差异表达基因（DEG），比对文献或数据库中的已知标记基因，最终为每个簇分配细胞类型。这一流程存在显著局限性：

1. 数据复杂性：不同组织和生物学背景下的细胞亚群具有特异性标记基因，缺乏通用的参考图谱。
2. 流程繁琐：手动筛选基因、查阅文献并排除噪声费时费力，且易受人为偏差影响。
3. 领域知识依赖：注释者需熟悉特定组织类型及其标记基因，限制了方法的普适性。

近年来，大型语言模型因其自然语言理解、代码生成及工具调用能力受到关注。研究者提出，配备自主规划能力的LLM智能体可能通过端到端自动化分析，克服传统方法的瓶颈，为单细胞转录组学研究提供新范式。

方法：LLM智能体的设计与实现

该研究开发了一种通用型生物信息学智能体，其核心在于通过高层目标驱动实现无参考细胞类型注释。

具体架构包括：

1. 任务无关的系统指令：仅提供高层次目标（如“标注每个簇的细胞类型”），无需详细步骤指导，赋予智能体自主规划能力。
2. 工具与代码集成：
   • 外部工具：支持PubMed摘要检索（get_pubmed_abstracts）和NCBI Entrez EUtils API（esearch、efetch、esummary），用于查询基因与细胞类型的关联。
   • 代码执行：智能体可编写并运行Python代码，分析差异表达基因（如计算Fold Change、过滤显著性标记）。
3. 多模型测试：对比三种前沿LLM——Claude 3.5 Sonnet、o3-mini和GPT-4o的表现，评估其稳定性与准确性。

实验使用10x Genomics Visium HD数据集，包括小鼠肾脏、大脑及人类扁桃体样本。每个数据集包含基于k-means聚类（k=10）的表达数据，智能体需根据基因表达特征推断细胞类型。金标准由病理学家提供，用于评估结果。

结果：性能对比与案例分析

性能对比

实验通过完成率、幻觉率及与金标准的对齐分数（1-4分）评估智能体表现，结果如下：

• Claude 3.5 Sonnet：完成率14/15，幻觉率2/15，对齐分数3.6-3.8，表现出色，标签细化能力强。
• o3-mini：完成率15/15，幻觉率4/15，对齐分数3.5-3.7，稳定性高但幻觉略多。
• GPT-4o：完成率仅3/15，幻觉率0/15，对齐分数2.4-2.6，因代码执行失败及标签粒度粗糙表现较差。

关键发现

1. Claude 3.5 Sonnet：在人类扁桃体数据中，能将“Epithelial/Mucosal Cells”细化为“基底上皮细胞（隐窝基层）”，并识别POU2AF1为生发中心B细胞标记，结合组蛋白基因（HIST1H1B、HIST1H1C）的高表达推断高增殖率。
2. o3-mini：任务完成率最高，但在某些情况下出现幻觉，如将“内皮细胞”误标为“间质细胞”。
3. GPT-4o：倾向于输出泛化标签（如“上皮/黏膜细胞”），且因编码错误导致任务失败率高。

案例分析：小鼠肾脏数据

以Claude 3.5 Sonnet为例，其分析流程如下：

1. 数据探索：读取聚类数据文件（如clustered.csv），提取差异基因（如Slc12a1、Umod）。
2. 文献检索：通过PubMed API查询基因功能（如“Slc12a1 AND thick ascending limb”）。
3. 结果整合：结合表达数据与文献，标注簇1为“厚升支（TAL）”、簇8为“远端小管（DCT）”、簇10为“尿路上皮细胞（标记Upk1b）”，并提供置信度评估。

幻觉模式

智能体偶现幻觉，主要表现为：

• 样本标签泛化：基于组织类型推测常见细胞类型，忽略实际基因表达。
• 虚假基因标记：引用非显著基因或错误表达方向（如将低表达基因误判为高表达）。

讨论：挑战与改进方向

尽管LLM智能体展现出自动化潜力，仍面临以下挑战：

1. 幻觉控制：模型需增强对数据特征的敏感性，减少对先验知识的过度依赖。可能的改进包括引入ReAct提示技术或多代理验证。
2. 工具扩展：集成更多数据库（如CellMarker、PanglaoDB）及分析功能（如富集分析），提升信息获取能力。
3. 领域适配：需验证模型在罕见细胞类型或复杂样本（如肿瘤微环境）中的泛化性。

未来可探索多代理协作框架，分担质量控制、注释和可视化任务，进一步提高效率和精度。

意义与展望

该研究表明，LLM智能体能够在仅依赖高层指令的情况下，自主完成单细胞转录组的细胞类型注释，展现出与人类专家相近的推理能力。其任务无关设计意味着潜在的广泛适用性，可能扩展至其他基因组学任务。研究者可关注以下方向：

• 工具开发：将智能体嵌入现有流程（如Scanpy插件）。
• 数据标准化：规范输入格式以降低解析难度。
• 知识增强：通过微调或检索增强生成（RAG）提升领域特异性理解。

尽管当前方法在稳定性和精度上需进一步优化，其“目标驱动”理念已为生物信息学自动化开辟了新路径。若能妥善应对幻觉和伦理风险（如错误信息传播），LLM智能体有望加速科学发现，成为生物医学研究的重要助手。

参考

Huang, Y., Cohen, I., Truong, V.Q.T., Bayat, P.B., Bhatti, S.A., Paruzzo, L., Painter, M.M., Zheng, S., Oldridge, D.A., Wagenaar, J. and Greenplate, A.R., Reference-free cell-type annotation with LLM agents. In ICLR 2025 Workshop on Machine Learning for Genomics Explorations.

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