RNA剪接扰动产生的肿瘤新抗原

Basic Information

• 英文标题：Generation of tumor neoantigens by RNA splicing perturbation
• 中文标题：RNA剪接扰动产生的肿瘤新抗原
• 发表日期：22 November 2024
• 文章类型：Review
• 所属期刊：Trends in Cancer
• 文章作者：Adi Rosenberg-Mogilevsky | Rotem Karni
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Highlights

• 一些肿瘤显示出特定且独特的剪接变化，突显了它们在癌症诊断和治疗中的潜在应用价值。
• 通过小分子干扰mRNA剪接会产生可以与MHC I类分子结合并发挥新抗原功能的肽。
• 在拼接调节领域的成功方法为利用这些策略在癌细胞中生成新抗原提供了有力证据。

Abstract

• 免疫治疗已经彻底改变了癌症治疗方式，但肿瘤特异性新抗原的有限可用性仍然是一个挑战。
• 由mRNA可变剪接衍生的新抗原作为新的免疫治疗靶点的潜力引起了广泛关注。
• 肿瘤表现出独特的剪接变化，并且剪接因子突变在多种癌症中普遍存在，对新抗原的产生起着关键作用。
• 研究人员提出了一些剪接调控方法，以增强抗肿瘤免疫反应，包括：
  • 小分子药物
  • 诱饵分子和剪接切换反义寡核苷酸（SSOs）
  • CRISPR基因编辑
  • 小干扰RNA（siRNA）
  • 无义介导的mRNA降解（NMD）抑制
• 这些策略可用于操纵剪接事件，从而增强新抗原的生成和免疫系统的识别能力。
• 最终，这些方法的临床意义值得深入探索，它们有望革新癌症免疫治疗并拓宽其应用范围。

Keywords

• RNA processing; immunotherapy; neoantigens; checkpoint inhibitors; RNA splicing

Advances in the field of neoantigens

Para_01

1. 近年来肿瘤学领域的一个重大突破是免疫治疗的发展。
2. 在免疫肿瘤学领域，免疫检查点抑制剂在某些癌症患者中展示了显著的抗肿瘤疗效[1,2]。
3. 癌症免疫治疗的其他策略包括细胞疗法[3]和癌症免疫化[4]。
4. 尽管取得了近期的成功，但将此类疗法扩展到更广泛应用的一个主要障碍是大多数癌症类型中缺乏可靶向的肿瘤特异性抗原（TSA）。
5. TSA包括可以被免疫系统识别的任何抗原（蛋白质/肽、糖类/糖、脂质、任何由肿瘤产生的分子）。
6. 在TSA中，新抗原是由癌细胞在致癌过程中或通过异常RNA加工获得的非同义突变产生的肽[5]。
7. 这些蛋白质可以在MHC I类分子上呈现，并被细胞毒性T细胞识别，从而激活针对呈递它们的肿瘤细胞的免疫反应[6]。
8. 另一类潜在的免疫调节因子是肿瘤相关抗原（TAA）。
9. TAA是在肿瘤中高表达但在正常组织中表达水平较低的蛋白质，可用于使肿瘤被免疫系统识别（例如，设计用于识别这些蛋白质的CAR-T细胞，或者结合这些蛋白质的一臂和T细胞的另一臂的双特异性抗体）。
10. 然而，并非所有肿瘤都会产生新抗原。
11. 肿瘤突变负荷是影响新抗原生成的关键因素。
12. 具有高突变负荷的肿瘤由于表达大量的异常蛋白而更容易被免疫系统识别[7., 8., 9.]。
13. 影响突变导致新抗原形成的另一个特征是突变类型。
14. 插入或删除（indel）突变，特别是移码indel，比单核苷酸变异（SNV）突变更能与抗肿瘤免疫反应相关联[10]。
15. 这是因为移码可以生成比单一氨基酸替换更长的肽段。

Para_02

1. ‘新生抗原’这一概念不仅限于肿瘤组织。
2. 其他病理情况也能诱导特定组织表达外源肽，从而激活免疫系统。
3. 自身免疫性疾病就是很好的例子，在这类疾病中正常组织会表达一种抗原，引发对表达这种抗原的细胞的免疫攻击。
4. 例如，1型糖尿病[11,12]和红斑狼疮[13,14]等疾病的亚型被发现会表达特定的剪接衍生抗原，引发免疫反应。
5. 同样地，剪接衍生的新生抗原也被发现在许多其他自身免疫性疾病中相关[15,16]。

Para_03

1. 新抗原特异性T细胞不受中枢和外周耐受机制的影响，并且由于它们对癌细胞的独特和特异性活性而缺乏诱导正常组织破坏的能力。
2. 该领域的新抗原研究进展导致了个性化免疫治疗的一种新形式的发展——基于新抗原的免疫治疗。
3. 目前，除了在检查点抑制剂功效中的重要作用外，利用新抗原作为癌症治疗方法主要有两种方法：过继性T细胞转移（ACT）和癌症疫苗。
4. 在ACT中，从患者体内分离出能够特异性识别新抗原的免疫细胞，在体外进行改造、扩增，然后重新输回患者体内。
5. ACT的另一个分支是CAR-T疗法，该疗法针对肿瘤细胞表面抗原来发挥治疗作用。
6. 值得注意的是，大多数CAR-T疗法靶向的是TAAs而不是肿瘤新抗原。
7. 尽管CAR-T疗法已被证明在治疗血液系统肿瘤方面有效，但在治疗实体瘤方面却显示出较少的成功，这可能是由于表面抗原数量有限或非特异性细胞靶向造成的。

Para_04

1. 当使用癌症疫苗时，会识别个体化的免疫原性抗原，并将合成的新抗原递送到患者体内，这些新抗原会在抗原呈递细胞（APCs）上呈现。
2. T细胞与APCs相互作用，激活、扩增，并浸润到肿瘤部位，在那里它们识别由MHC I类分子呈递在肿瘤表面的相应抗原，并特异性地杀死携带这些抗原的肿瘤细胞[22]。
3. 尽管在识别新抗原方面已经取得了显著进展，但个性化新抗原为基础的治疗性癌症疫苗的开发仍然面临重大障碍[23,24]。
4. 此外，可以预期在肿瘤发展过程中会对有效的新抗原进行选择，以避免对表达这些新抗原的细胞进行免疫攻击。
5. 另一种最近的方法是利用致癌驱动突变作为新抗原靶点，该突变对于肿瘤生长至关重要。
6. 两个独立的小组开发了一种新的方法，涉及共价抑制剂突变型KRAS（G12C），以生成药物偶联的新抗原。
7. 通过使用双特异性抗体，其中一个臂识别药物偶联的新抗原，另一个臂结合到细胞毒性T细胞上的TCR CD3共受体，他们能够证明药物处理过的KRAS突变肺癌细胞的细胞毒性T细胞介导的杀伤作用[25,26]。
8. 这些研究证明了不仅天然的翻译后修饰肽可以在MHC复合物相关的新抗原中呈现，而且合成的共价修饰肽也可以呈现。

Para_05

1. 为了扩大免疫治疗的适用目标范围，最近的研究集中在mRNA剪接和选择性剪接作为产生新抗原的新兴机制[27., 28., 29., 30., 31., 32.]。
2. 在这篇综述中，我们讨论了选择性mRNA剪接产生的新抗原作为新的免疫治疗目标的潜力。
3. 我们描述了可以用来实现抗肿瘤免疫反应的不同剪接调节方法。
4. 最后，我们讨论了这一新兴领域可能的改进和未来的发展方向。

Alternative splicing in cancer immunotherapy

Para_01

1. 此前已经确定肿瘤表现出特定和独特的剪接变化，这表明它们在癌症诊断和治疗中的适用性。
2. 在过去二十年中发现了导致产生肿瘤特异性剪接事件的几种机制（参见[35][36][37]）。
3. 除了对癌症免疫疗法日益增长的兴趣外，有关替代剪接作为癌症免疫疗法靶点的潜力的新数据正在涌现。
4. 鉴于大型数据库如癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）项目的扩展，许多研究集中于正常和恶性组织中的剪接分析，为这一领域的发展铺平了道路。
5. 这些研究表明，源自肿瘤特异性mRNA剪接事件的肽有可能与MHC I类分子结合，并诱导针对这些肽的特异性CD8+T细胞。
6. 因此，这些肽可作为真正的新抗原（图1，关键图）。

图片说明◉ 图1。关键图。可变剪接衍生的新抗原的产生。

Para_01

1. 不同于源自SNV突变的患者特异性新抗原，源自选择性剪接的新抗原可能具有被多个肿瘤广泛共享的优势，从而允许通用治疗方法。
2. 源自选择性剪接的肿瘤特异性抗原的另一个好处是它们与自身抗原更为不同，并且含有多个氨基酸的变化而不是单一的改变，这使得它们可能比SNV新抗原具有更大的免疫原性。
3. 对多种癌症类型的RNA剪接进行全面分析发现，肿瘤中的剪接变化比正常细胞更多，并且癌症中存在许多新的剪接事件。
4. 他们还报告称，肿瘤mRNA包含多个蛋白编码外显子-外显子接头（新接头），这些接头通常在正常样本中找不到。
5. 通过这种方法鉴定出的许多肽也被预测为MHC I类分子的结合物，并且是优秀的潜在新抗原候选者。
6. 最近的研究证实了肿瘤特异性剪接新接头确实被表达并在MHC-1分子上呈现，并能够激活T细胞免疫反应。

Para_02

1. 虽然盒式外显子拼接（也称为外显子跳跃）是最常见的可变剪接类型[44,45]，新抗原也可以来源于其他事件，尤其是内含子保留。
2. 已经开发出一种方法来识别源自肿瘤转录组中内含子保留事件的新抗原。
3. 该方法应用于两个接受检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者队列的肿瘤测序，导致验证了由保留内含子产生的新抗原被加工并在癌细胞表面的MHC I类分子上呈现出来[20]。
4. 另一项研究分析了来自19名急性髓系白血病（AML）患者的样本，并发现了58种主要由内含子保留事件引起的新抗原。
5. 有趣的是，这19名患者中的大多数新抗原是共享的。
6. 在同一研究中，在一个包含437名共享这些抗原的AML患者的队列中，预测的TSAs数量与生存率提高相关[46]。
7. 对癌细胞通过MHC-I分子呈现在癌细胞上的新抗原的蛋白质组学分析显示，许多新抗原来源于可变剪接[32]。

Para_03

1. 正如将在以下章节讨论的，许多在AML和其他癌症中表达的新抗原是由发生于约30％患者的剪接因子突变产生的。
2. 这项研究和其他报告新抗原识别和预测进展的研究[27, 28, 29]展示了开发新型癌症治疗方法的巨大潜力。
3. 这对于AML，慢性淋巴细胞性白血病（CLL），胶质母细胞瘤和葡萄膜黑色素瘤等癌症尤为重要，这些癌症以前发现无法从创新免疫疗法中受益。
4. 由于缺乏由低突变负荷引起的突变衍生的肿瘤特异性抗原[48,49]，这些癌症目前主要通过化疗进行治疗。
5. 除了突变和剪接变化外，新抗原的另一个来源可以是A到I的RNA编辑，其中腺苷（A）通过ADAR酶催化水解脱氨转化为次黄苷（I）[50,51]。
6. 该领域的进展正在推动癌症免疫治疗的新时代，为潜在疗法带来了令人兴奋的机会。

Splicing factor mutations in cancer

Para_01

1. 剪接因子的突变最初在骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）中被发现[47,52]，后来在几种其他类型的癌症中也发现了，包括葡萄膜和黏膜黑色素瘤[53,54]、乳腺癌[55]、肺癌[56]和其他实体瘤[57]。对TCGA数据的分析显示，剪接因子基因在几种癌症类型中携带潜在的驱动突变[58,59]。此前有人提出，剪接因子的突变可能导致新生抗原的产生[60]。
2. 特定于癌症的剪接因子突变可以通过诱导剪接变化来影响它们的活性，这种变化可能会导致外显子中的移码，最终编码出可能由MHC I类分子呈递的潜在新生抗原（图1）。这些突变可能有助于开发专门针对癌细胞而不损害正常细胞的新免疫治疗策略。
3. 源自剪接因子突变的新生抗原对于肿瘤突变负荷较低的癌症类型尤为重要，例如MDS和其他已知具有剪接因子突变的血液系统恶性肿瘤[47,61]。
4. 在一项评估113名骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者中潜在新生抗原的综合分析中，研究人员发现SF3B1突变的患者表现出独特的3'剪接模式，这种模式可能具有蛋白质改变的潜力。他们验证了预测的一些肽是强效的MHC I类结合物，通过体外预测肽与MHC蛋白的直接结合，但未在体内进行验证[32]。
5. 另一项研究比较了携带SF3B1突变的葡萄膜黑色素瘤患者与野生型SF3B1患者以及健康供体中的潜在新生抗原诱导情况。他们巧妙地证明，SF3B1突变产生了仅在肿瘤细胞中表达的免疫原性新生抗原，并且这些抗原在肿瘤部位被T细胞识别。最终，特异性CD8+ T细胞杀死了表达新生抗原的突变SF3B1癌细胞[62]。
6. 这项开创性研究强调了筛查具有过表达和/或独特突变的剪接因子的特定癌症中新生抗原的重要性。在涉及APCs和通常也属于恶性克隆的T细胞的血液癌症中进行类似的研究将是有益的。

Para_02

1. 免疫肽组学分析在几种类型的癌症中发现了肿瘤特异性剪接事件，据预测这些事件会产生肽，并呈现在MHC-I和-II分子上[31,32]。
2. 另一份最近的报告表明，通过抑制磷酸酶2A和5（PP2A/PP5）导致的剪接扰动产生了新的新抗原，这些新抗原呈现在MHC-1分子上[41]。
3. 此外，最近的一份报告在人类中识别出了呈现在MHC-I分子上的由肿瘤特异性剪接衍生的新抗原以及反应针对它们的CD8+ T细胞克隆[30]。
4. 综上所述，这些报告提供了证据支持结论：肿瘤特异性剪接是人类肿瘤新抗原的重要来源。

Splicing modulation

Para_01

1. 对剪接在疾病中的作用的理解进展，特别是在癌症中，推动了各种调节剪接的治疗手段的进步。
2. 剪接过程中众多的相互作用和调控元件提供了多种操纵的机会。
3. 靶向癌症中剪接的主要方法包括：（i）调节核心剪接体，（ii）针对如丝氨酸-精氨酸富含（SR）蛋白等剪接调控蛋白，以及（iii）操控直接改变单个mRNA剪接的成分（已在文献[63]中综述）。
4. 这一快速发展的领域为将这些方法应用于癌细胞的新生抗原生产提供了有力的理由。
5. 在接下来的部分中，我们将重点介绍几种已被用于新生抗原生产的剪接调节方法，其中一些方法已显示出能够引发免疫反应。
6. 此外，我们还将讨论尚未用于新生抗原生产的其他方法。

Splicing modulation by small-molecule drugs can trigger antitumor immune activation

小分子药物的拼接调节可以触发抗肿瘤免疫激活

Para_02

1. 小分子是具有低分子量的有机化合物，具有能够到达广泛的细胞外和细胞内靶点的优势。
2. 多年来人们已经知道小分子可以与RNA结构结合，并通过阻止它们的翻译或功能来直接调节剪接。
3. 最早被研究用于剪接调节的成分是天然产物衍生的药物，这些药物抑制剪接因子SF3B1，随后不久就开发出了合成类似物。
4. 此外，一些抗癌药物被发现会影响选择性剪接，主要是通过抑制剪接体组装。
5. 例如，一项测试了20种最常见化疗药物的研究发现，几乎每一种药物都会改变各种癌细胞系中的一组替代剪接事件，其中12种药物改变了BCL-x基因的剪接以促进促凋亡异构体的产生。
6. 最近的研究证明了使用药理学抑制剪接体来触发抗肿瘤免疫激活的方法。
7. 一份报告分析了使用Sudemycin D6或H3B-8800（两种使SF3B剪接复合物失活的剪接体调节剂）治疗MYC驱动的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系的效果。
8. 他们表明，剪接体抑制导致保留内含子的RNA在细胞质中形成双链（dsRNA）结构。
9. 在免疫能力小鼠中移植不同肿瘤模型后使用剪接体抑制药物治疗，导致抗病毒和适应性免疫信号上调，并显著抑制肿瘤进展。
10. 尽管作者关注于dsRNA的积累及其识别机制，但他们无法排除其他机制（如新抗原表达）对增加免疫信号的贡献。
11. 另一项平行研究测试了剪接生成的新抗原的扰动是否可以直接引发抗肿瘤反应。
12. 在这项研究中，他们表明通过特定药物（indisulam，已知通过RBM39失活影响RNA剪接，以及MS023，已知通过PRMT抑制影响RNA剪接）进行药理学剪接调节可以直接诱导免疫原性新抗原。
13. 他们在免疫能力小鼠和免疫缺陷同基因黑色素瘤和结肠腺癌模型中测试了这些药物的体内反应。
14. 他们的结果显示，免疫能力小鼠表现出依赖T细胞和肿瘤MHC-I表达的肿瘤生长减少。
15. 此外，这些药物通过诱导由MHC-I呈递的新抗原增强了免疫检查点阻断效果。
16. 另一项最近的研究评估了一种称为RECTAS的小分子剪接调节剂的抗肿瘤效果。
17. RECTAS是一种合成化合物，通过靶向CDC样激酶（CLKs）促进特定SR蛋白的活性。
18. 他们发现RECTAS以CD8+ T细胞和肿瘤MHC I类依赖的方式抑制肿瘤生长，并增强PD-1阻断效果。
19. 此外，他们发现RECTAS治疗导致新抗原的诱导。
20. 这些研究表明，针对剪接体和剪接因子的疗法作为新抗原来源的潜力。
21. Rebecsinib和其他已知是剪接调节剂的小分子可以筛选出类似的效果以增加新抗原的产生。

Para_03

1. 总体而言，使用小分子调节剪接的优势在于这些分子易于进入器官、肿瘤和恶性组织，并且相对容易合成。
2. 然而，也存在缺点。目前大多数剪接因子被认为是不可成药的，因此每个靶点都需要进行高通量的小分子筛选。
3. 此外，剪接因子不是酶，因此高效的抑制可能需要较高的摩尔比。

Enhancing neoantigen presentation by decoy oligonucleotide modulation of splicing

通过诱饵寡核苷酸调节剪接增强新抗原呈递

Para_02

1. 迄今为止开发的大多数小分子通过影响整个剪接体而不是特定的剪接因子来调节剪接。
2. 最近的一份报告提出了一种通过抑制特定剪接因子活性来改变剪接的新方法[79]。
3. 在这项工作中，他们设计了化学修饰的RNA诱饵寡核苷酸，由几个重复的识别单个剪接因子的RNA基序组成。
4. 使用针对剪接因子SRSF1或PTBP1的诱饵寡核苷酸在癌细胞系中的应用导致了致癌特性的抑制，并改变了它们靶基因的剪接。
5. 此外，诱饵寡核苷酸在体内抑制了肿瘤生长，表明这种方法具有治疗潜力。
6. 这种用于操纵剪接的创新技术可以测试是否能够诱导新抗原和免疫反应在免疫能力的小鼠中。
7. 进一步分析用不同剪接因子的诱饵寡核苷酸处理后的癌细胞产生的RNA转录物是必要的，以便识别可能作为潜在新抗原的剪接异常。

Para_03

1. 总的来说，脱氧寡核苷酸可以基于它们的RNA结合基序设计来针对许多不同的剪接因子，使这种方法具有适应性。
2. 此外，它们易于合成，并且具有相同的化学性质，因此它们的基本毒性已经为人所知。
3. 这种方法的缺点是向组织和肿瘤中的传递效率低下，需要专门的传递技术，如纳米颗粒或特定偶联物。
4. 另一个缺点是靶向非突变剪接因子可能会导致毒性。

Enhancing neoantigen presentation by CRISPR, SSOs, and siRNA modulation of splicing

通过CRISPR、SSOs和siRNA调控剪接增强新抗原呈递

Para_02

1. 操纵选择性剪接作为癌症治疗的一种方法最近已被综述。
2. CRISPR/Cas9系统是一种最初在细菌中发现的简单的DNA编辑工具，现已修改用于多种应用，如基因编辑。
3. 使用CRISPR/Cas9进行免疫治疗已经得到了广泛的研究，各种临床试验正在进行，以检查CRISPR/Cas9编辑的T细胞在多种癌症中的抗肿瘤活性。
4. 此外，CRISPR筛选可以用于识别新的免疫介质，并发现参与抗肿瘤免疫的遗传和细胞调节因子。
5. 研究表明，CRISPR/Cas9基因编辑可以诱导小的插入或删除，部分改变剪接，或者较大的删除，去除外显子。

Para_03

1. 使用CRISPR/Cas9基因编辑进行剪接调控可以用于新抗原的生成。
2. 在癌症细胞中识别出候选的新抗原后，类似于[28]中所报道的，可以通过CRISPR/Cas9操纵癌细胞产生特定的新抗原，这有望引发更强的免疫反应。
3. 使用与DNA结合而不是RNA结合的CRISPR/Cas13来调控剪接是一种直接的方法。
4. 使用失活的Cas13，设计用于特定RNA位置的引导RNA（gRNA）招募失活的Cas13，从空间上阻断剪接因子并改变剪接[85]。
5. 理论上，这种方法可以使任何能够产生新抗原的剪接事件得到特异性调控[86]。
6. 使用CRISPR/Cas调控剪接的优势在于其高度特异性，因为它可以靶向独特的剪接事件。
7. 然而，这可能的缺点是产生单一新抗原可能不足以引发免疫反应。
8. 大型CRISPR/Cas复合体的传递是另一个问题，因为在肿瘤组织中表达大型蛋白质复合体仍然是一项挑战。

Para_04

1. 一种替代的剪接操作策略是使用剪接切换反义寡核苷酸（SSOs）。
2. SSOs 是长度为 15-30 nt 的 RNA 分子，设计用于立体阻碍剪接因子在前 mRNA 上的结合位点。
3. 通过这种方式，SSO 改变了剪接体对剪接位点的识别，从而改变了目标转录物的剪接，但并不一定会改变转录物的数量。
4. SSOs 可以靶向 3' 或 5' 剪接位点，并通常导致外显子跳跃。
5. 它们也可能通过掩蔽外显子或内含子中的特定序列来抑制辅助剪接因子的结合，这些序列不在 3' 或 5' 剪接位点。
6. 类似于 CRISPR 方法，我们建议可以使用 SSOs 来操纵被鉴定为新抗原候选者的特定基因的剪接，从而产生能够触发免疫系统的异常肽。
7. 使用 SSOs 调节剪接事件的优点是非常特异性的。
8. 通过使用多个 SSOs 可以同时靶向多个剪接事件。
9. 研究表明，SSOs 通过偶联物可以有效地传递到特定器官和肿瘤（如肝脏、肺和肾脏），并且是有效的剪接调节剂。
10. 然而，对于大多数其他肿瘤来说，传递仍然是一个挑战。
11. 类似于诱饵寡核苷酸，所有 SSOs 都具有相同的化学性质，其基本毒性已知，且 SSOs 容易合成。

Para_05

1. 一种研究较少的方法是使用小干扰RNA（siRNA）通过剪接调节诱导新抗原。
2. siRNA是双链RNA，它们与特定的mRNA序列杂交以诱导其沉默或降解。
3. 研究表明，靶向接近替代外显子的序列的siRNA可以调节其选择性前mRNA剪接[88]。
4. 这项独特研究提出了将siRNA用作潜在新抗原靶基因的剪接调节方法的可能性。
5. 此外，siRNA可用于沉默在癌细胞中上调的剪接因子。
6. 下调一个剪接因子将导致多种剪接变化，这些变化可能引起移码翻译、异常肽的产生和新抗原的诱导。
7. 与SSOs类似，siRNA具有特异性，易于合成，并且其基本毒性已经得到研究。
8. 这种方法的缺点是，对于大多数组织和肿瘤，在没有偶联物的情况下传递效率不高。
9. 此外，设计一种有效的siRNA来调节剪接已被证明是困难的，并且使用siRNA沉默剪接因子可能导致毒性。

Enhancing neoantigen presentation by modulating nonsense-mediated RNA decay (NMD)

通过调节无义介导的RNA降解来增强新抗原的呈递

Para_02

1. NMD是一种选择性降解携带提前终止密码子（PTC）的mRNA的质量控制机制，这些PTC是由无义突变、插入或删除引起的框移或mRNA加工错误造成的。
2. 这种降解阻止了缺陷截短蛋白的翻译。
3. 在这个过程中，位于PTC下游的外显子连接复合物（EJC）与在PTC处组装的NMD蛋白相互作用，触发mRNA的分解[89]。
4. 许多内源性mRNA转录本也包含一个编码PTC的外显子，称为毒饵外显子。
5. 此外，跳过或包含一个核苷酸数目不是三的倍数的外显子会导致通过NMD途径的降解。
6. 因此，当包含这样一个可变剪接外显子时，转录本被降解，该转录本的表达受到下调。
7. 这代表了一种平衡生产性和非生产性mRNA异构体比例的基因调控机制[90]。
8. 因为新生抗原的产生取决于肿瘤中积累的框移突变的数量，而框移突变通常导致PTC，有人提出NMD可能参与免疫治疗的效果[91]。
9. 一种由于某种原因逃避NMD的含有PTC的转录本可以被翻译成产生截短蛋白，或者生成编码肽的改变读码框，该肽作为新生抗原。
10. 一项开创性的研究提出了将NMD抑制作为刺激抗肿瘤免疫力的一种方法。
11. 研究表明，通过siRNA介导的NMD抑制在肿瘤细胞中的抑制可以诱导新的强有力的抗原，从而引发免疫反应并最终抑制肿瘤生长[92]。
12. 此外，5-氮杂胞苷（用作NMD抑制剂）稳定了携带框移的转录本，并增加了HLA分子上的肽呈现[93]。
13. 另一项研究报告了开发了一个原始资源NMDetective来预测PTC沿基因组的影响。
14. 发现可以根据特定含有PTC的转录本是否受NMD影响来预测免疫治疗的效果[94]。
15. 他们进行了泛癌队列分析，表明逃避NMD的框移突变与肿瘤免疫反应相关，这些肿瘤对免疫治疗的反应也更好。
16. 在一项相关研究中，使用配对DNA和RNA测序数据中的等位基因特异性框移插入缺失检测来识别逃避NMD并引发抗肿瘤免疫反应的肿瘤中的框移突变[95]。
17. 他们发现，在四个独立的黑色素瘤队列中，逃避NMD的突变与免疫检查点抑制剂治疗的临床益处显著相关。
18. 此外，他们分析了个性化抗肿瘤疫苗研究的数据，发现了证据表明，由框移插入缺失衍生的新生抗原引发了免疫反应。
19. 最近的数据表明，通过IL6/STAT3通路上调主要NMD激活激酶SMG1的活性，导致了抗肿瘤免疫反应的减少[96]。
20. 此外，在某些癌症中，癌细胞增强了NMD过程，以帮助它们应对失控的转录和剪接产生的有毒RNA种类，这有助于恶性表型。
21. 因此，在NMD激活的特定肿瘤中，通过NMD抑制增强新生抗原的产生可能是有效的[97,98]。
22. 综合来看，这些发现表明，活跃的NMD阻止了新生抗原的表达，从而降低了癌症免疫治疗的效果。
23. 这提出了这样一种可能性：NMD抑制剂如NMDI-1、5-氮杂胞苷和氨来吖啶（在[99]中回顾），或其他抑制NMD的策略，可能是诱导各种肿瘤特别是那些不响应免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤的新生抗原的有效策略。
24. 正如前文所述，小分子具有易于递送到组织和肿瘤的优势。
25. 与针对单个剪接事件的方法不同，小分子可能由于大量不同的新生抗原的累积而具有广泛的免疫效应。
26. 然而，这种广泛的效果可能会导致更高的毒性，甚至在正常组织中也是如此。

Concluding remarks and future perspectives

Para_01

1. 对利用新生抗原进行癌症免疫治疗的兴趣日益增长，推动了该领域取得重大进展。
2. 然而，关键挑战仍然是许多癌症类型中免疫原性抗原的稀缺。
3. 最近，人们开始关注RNA加工在产生新生抗原中的作用，以及调节RNA加工以增强新生抗原产生的潜力。
4. 在这篇综述中，我们提出了几种操纵剪接或RNA稳定性的方法，这些方法可以诱导新生抗原的产生（图2）。
5. 异常RNA加工可以通过几种方式导致特定肿瘤新生抗原的产生：
6. (i) 原癌基因激活（突变/易位/基因扩增）引起的转录增加（例如，MYC扩增）会导致高转录压力，从而引起剪接错误，而这些错误将因额外的剪接扰动而加剧。
7. (ii) 剪接因子突变（发生在某些特定癌症的亚群中）可以产生新生抗原；此外，抑制mRNA降解（例如通过NMD抑制）有望诱导异常肽的表达，这些异常肽可被检测为新生抗原。
8. (iii) 另一种提出的但尚未证实的方法是通过特意设计的剪接扰动故意产生新生抗原。
9. 如果这种方法应用于仅在肿瘤中存在的mRNA，则对正常组织的影响应该是最小的。

图片说明◉ 图2。生成RNA加工衍生新抗原的方法。

Para_01

1. 拼接调节生成新抗原的优势是多方面的：(i) 拼接调节产生的外来肽比大多数基因组突变更长，而这些突变通常是单一氨基酸的变化。(ii) 活化T细胞疗法和mRNA疫苗依赖于肿瘤内生成的一部分新抗原，这些新抗原是在免疫系统强烈选择下进化的，因此可能不如异常拼接扰动产生的新型肽更具免疫原性。(iii) 拼接调节依赖于肿瘤的内源性拼接机制，因此不需要体外操作，而这些操作具有挑战性和高成本。
2. 当然，拼接调节方法也存在许多障碍，例如将寡核苷酸递送到肿瘤中。此外，与任何治疗方法一样，可能会对正常细胞/组织产生不良影响。最终，这种方法的成功将取决于治疗窗口。

Para_02

1. 我们讨论过的两种改变RNA剪接的方法——小分子和SSO——已经用于治疗遗传疾病，使它们成为癌症治疗新生抗原生成的有利选择。
2. 一些已被批准用于除剪接调控以外目的的小分子也被发现可以调节选择性剪接[103]。
3. SSO也已被批准用于临床，例如Spinraza®用于治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）[104]。
4. 如上所述，这些治疗方法的主要问题之一是递送。
5. 当比较这两种方法时，小分子在靶向位点递送方面具有明显的优势。
6. 尽管几种SSO递送策略取得了进展，包括化学修饰、生物缀合和使用纳米颗粒，但递送仍然是一个主要障碍[87]。
7. 这些治疗方法的另一个主要问题是特异性。
8. SSO由于与特定的RNA序列相互作用而具有目标特异性。
9. 另一方面，小分子通常会改变剪接体或剪接因子的活性，导致广泛的改变，影响多个RNA分子，因此存在较高的脱靶效应风险。
10. 我们上面讨论的另外两种技术，CRISPR/Cas和诱饵寡核苷酸，有可能通过调节选择性剪接来诱导免疫原性新生抗原，但目前还不适用于患者治疗。
11. CRISPR/Cas的递送也是一个问题，因为它是一个相对较大的RNA-蛋白质复合物（参见未解决问题）。

Para_03

1. 众所周知，免疫检查点抑制剂，如抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4，可以改善新抗原疫苗治疗的效果，这一点已通过大量临床试验得到证实[22]。
2. 沿着这一思路，我们建议将剪接调节策略与免疫检查点抑制剂结合使用，可以增强抗肿瘤免疫反应的效果。
3. 这一方法的概念验证已在最近的两项报告中得到展示。
4. 一项研究表明，使用剪接调节药物与抗PD-1联合治疗比单独使用剪接调节药物或抗PD-1治疗更能减少肿瘤生长并提高生存率[74]。
5. 另一项研究发现，剪接调节分子RECTAS与抗PD-L1联合使用，可以增强RECTAS或抗PD-L1单独作用于肿瘤生长和肿瘤浸润性CD8+T细胞的效果[75]。
6. 此外，研究还表明，那些逃脱NMD的突变，因此是潜在的新抗原来源，与对免疫检查点抑制剂治疗的改善反应相关[94,95]。
7. 这些发现表明，逃脱NMD的突变数量可以用作免疫治疗反应的生物标志物，并且在个性化免疫治疗设计过程中可能有所帮助[91]。

Para_04

1. 最后，鉴于mRNA疫苗在安全性、有效性以及生产便利性方面的优势，对其开发的兴趣日益增长。
2. 选择性剪接作为潜在靶点的一个重要来源，在这些疫苗中起着核心作用[105]。
3. 总之，我们预计这里介绍的各种方法的发展将彻底改变癌症治疗，并扩大免疫疗法的疗效，使其惠及目前无法从中受益的患者。
4. 关键问题是什么样的肿瘤类型最适合通过剪接调节来产生新抗原？
5. 如何提高基于SSO、诱饵分子和CRISPR介导剪接的剪接调节策略的递送效率？
6. 如何最大化剪接调节的特异性以防止广泛的变化导致脱靶效应？
7. 如何将剪接调节与检查点抑制剂结合使用以增强抗肿瘤反应？

Author contributions

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1. 手稿由所有合著者准备和编辑。
2. ,

Acknowledgments

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1. R.K.实验室的工作得到了Melanoma Research Alliance（MRA，团队奖926698）的资助，一个Horizon Europe联盟赠款（CANCERNA 101057250）的资助，Binational Science Foundation（BSF，2021108）的资助，Israel Cancer Research Fund（ICRF）研究教授基金（PROF-22602）的资助，以及Israel Science Foundation（ISF，1601/23）的资助。
2. 这些图是使用BioRender创建的。