时空组学

Basic Information

• 英文标题：Single-cell multi-stage spatial evolutional map of esophageal carcinogenesis
• 中文标题：食管癌发生单细胞多阶段空间演化图谱
• 发表日期：10 March 2025
• 文章类型：Article
• 所属期刊：Cancer Cell
• 文章作者：Jiang Chang | Chen Wu
• 文章链接：

Highlights

Para_01

1. 单细胞空间图谱描绘了人类食管鳞状细胞癌的进化轨迹
2. 侵袭性细胞通过破坏上皮-基质界面推动食管鳞状细胞癌的发展
3. JAG1-NOTCH1信号通路促进CAFs与上皮细胞生态位的形成，从而实现免疫逃逸
4. CAFs与上皮细胞生态位预测鳞状细胞癌的进展和预后

Summary

Para_01

1. 癌症的发展涉及癌细胞与其周围微环境的共同进化，但这种相互作用在物理结构中的动态过程仍知之甚少。
2. 在这里，我们展示了单细胞分辨率的空间转录组图谱，涵盖了来自43名患者的127个多阶段视野，以绘制人类食管鳞状细胞癌（ESCC）的进化轨迹。
3. 通过分析640万个细胞，我们揭示了ESCC的进展是由一种获得去分化和侵袭性特征的增殖上皮细胞亚群驱动的。
4. 在晚期癌前阶段，这些细胞破坏了上皮-基质界面，并通过JAG1-NOTCH1信号通路招募正常成纤维细胞，将其转化为癌症相关成纤维细胞（CAFs）。
5. 这种相互作用导致在肿瘤边缘形成了一种"CAF-Epi"（CAF和上皮细胞）生态位，该生态位可以保护肿瘤免受免疫监视。
6. CAF-Epi生态位的形成是ESCC及其他鳞状细胞癌进展的关键指标，也是患者预后的关键指标。

Graphical abstract

Keywords

• spatial transcriptomics; Xenium In Situ; cancer evolution; cancer-associated fibroblast; extracellular matrix remodeling; SPP1+ macrophage; regulatory T cell; immune escape; NOTCH1

Introduction

Para_01

1. 理解致癌过程中复杂的机制对于探索肿瘤进化和识别早期干预的目标至关重要。
2. 最近基因组学和单细胞转录组学的进步揭示了突变（如TP53、NOTCH1等）在肿瘤细胞中的关键作用
3. 以及上皮细胞和基质细胞群在推动癌变发展和进展中的复杂相互作用。
4. 然而，许多这些研究缺乏空间分辨率，限制了我们完全理解癌症细胞进化背后的分子机制和细胞间相互作用的能力。
5. 为了克服这一限制，需要进行高分辨率的空间转录组分析，以系统地绘制出致癌过程中细胞状态的空间动态变化。
6. Xenium In Situ 和 TF-seqFISH 平台已成为两种开创性的高通量技术，用于在大范围连续样本中对数百到数千个RNA靶标进行亚细胞定位。
7. 它们能够以前所未有的单细胞分辨率详细可视化和空间分析细胞结构和功能，因此代表了研究肿瘤空间进化理想工具。

Para_02

1. 食管鳞状细胞癌（ESCC）是进行这种时空癌症发生研究的理想模型系统。
2. 食管具有一个特征明确的空间结构，包括多层食管上皮基底层，该层容纳了响应于上皮更新的干细胞。
3. 在这之上，副基底层和表面层由处于不同分化阶段的细胞组成，形成了鳞状上皮的保护性外屏障。
4. 在上皮下方，成纤维细胞维持细胞外基质（ECM），提供结构支持，并分泌对伤口愈合和免疫细胞招募至关重要的生长因子、细胞因子和趋化因子。
5. ESCC 通过两个可识别的癌前病变进展：低级别和高级别上皮内瘤变（LGIN 和 HGIN），
6. 这两种病变可以通过活检采样，从而详细理解驱动 ESCC 进展的细胞和分子变化。

Para_03

1. 我们应用了Xenium In Situ和TF-seqFISH空间转录组学平台，在食管组织切片上检测了1,536个独特的基因，并整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，系统地捕捉食管鳞状细胞癌（ESCC）发展的连续阶段。
2. 这一策略使我们能够以前所未有的细节构建ESCC发展的单细胞分辨率多阶段空间图谱。
3. 与这张地图一起，我们开发了生物信息学方法，并进行了体外和体内功能实验，这些实验共同带来了对驱动ESCC发展的空间相互作用模式更深入的理解。
4. 因此，这项研究揭示了细胞状态的演变、空间组织及其相互作用如何驱动形成一个具有免疫抑制微环境的"CAF-Epi"（CAF和上皮细胞）生态位的过程，这个过程也在其他类型的鳞状细胞癌（SCC）中被观察到。
5. 这些全面的见解使得癌症进展的更准确分期成为可能，并提高了泛鳞状细胞癌患者预后的预测能力。

Results

Multi-stage spatial transcriptomic analysis reveals cell choreography in ESCC development

多阶段空间转录组学分析揭示了ESCC发展中细胞的协同作用

Para_01

1. 在这项研究中，我们对来自43名患者的总共127个视野（FOVs）进行了空间转录组学分析，这些患者代表了ESCC发展的多个阶段，包括45个正常食管上皮（NOR），25个轻度不典型增生（LGIN），21个重度不典型增生（HGIN）和36个ESCC视野（图1A；表S1）。
2. 我们从6名患者的整个食管组织中获得了71个视野（包括24个NOR，15个LGIN，16个HGIN和16个ESCC），每个视野涵盖了多个病理阶段，以便于评估疾病进展过程中细胞演化的连续性。
3. 为了确保我们的结果不受个别患者的影响，我们还分析了来自另外37名患者的56个视野（包括21个NOR，10个LGIN，5个HGIN和20个ESCC）。

图片说明◉ 图1 单细胞空间转录组学分析揭示了食管癌发生过程中的动态细胞群（A）本研究中食管鳞状细胞癌时空转录组学分析示意图。（B）UMAP图显示ESCC肿瘤发生过程中样品中的细胞群。（C）点图显示标记基因在不同细胞群中的标准化RNA水平。（D）代表性视野的空间转录组学图谱。（E）箱线图显示NOR（n = 45）、LGIN（n = 25）、HGIN（n = 21）和ESCC（n = 36）阶段每个视野中不同细胞群的平均密度。箱体表示中位数（中央线）和第25至75百分位数（箱体边界），须表示1.5倍四分位距。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验。另见图S1及表S1和S2。

Para_01

1. 空间转录组学分析使用了来自10×基因组学的Xenium In Situ平台，提供了单细胞分辨率分析，涉及6,442,006个细胞中的300个基因（参见STAR方法；表S2和图1A-1C）。
2. 我们还应用TF-seqFISH平台对另外两张包含NOR、LGIN和HGIN的组织切片进行了分析，以验证并通过Xenium In Situ空间转录组学分析来扩展结果，在21,999个细胞上检测了1,471个基因（参见STAR方法；表S2）。
3. 此外，我们整合了来自143个多阶段样本的scRNA-seq数据，总共包括385,151个细胞。
4. 这一全面的方法使我们能够详细研究食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中的细胞状态和细胞间相互作用。

Para_02

1. 每个视野包含上皮细胞、基质细胞和免疫细胞的异质混合（图1D和S1）。
2. 我们计算了每个视野中每种细胞类型的密度，以评估ESCC发展中细胞结构的变化（图1E）。
3. 与NOR阶段的2.39相比，T细胞密度在LGIN阶段显著增加（3.60，p = 0.013），在HGIN阶段也显著增加（3.42，p = 0.035）。
4. 这表明在这些癌前病变阶段，免疫反应被激活了。
5. 然而，与HGIN阶段相比，ESCC阶段的T细胞密度显著下降（2.58，p = 0.044），表明ESCC微环境中的免疫状态从激活转向抑制。
6. 此外，我们发现HGIN阶段（4.54，p = 0.001）和ESCC阶段（5.36，p = 1.2e-6）的髓系细胞密度升高，而NOR阶段为3.17，这表明髓系亚型呈现促肿瘤分化。

Expansion of proliferative and invasive epithelial subpopulations drives ESCC development

增殖和侵袭性上皮亚群的扩展驱动了ESCC的发展

Para_01

1. 为了描绘肿瘤发生过程中上皮细胞的演变，我们描述了在ESCC发展过程中的多个阶段中包含的1,923,352个上皮细胞的4个主要亚群（图2A、S2A和S2B）。
2. 每个上皮细胞亚群表现出独特的表达谱，并通过多阶段样本的scRNA-seq数据进一步验证（图2B）。
3. 我们发现，在NOR阶段，分层的复层上皮保持完整，具有连续的基底膜，并且三个上皮细胞亚群位于其上方（图2C和S2C）。
4. 基底细胞（n = 80,065）表现出与去分化相关的表达程序（如ITGA6、NOTCH1和COL17A1）。
5. 增殖细胞（n = 126,560）表现为与细胞周期（如MYC、JAG1和TOP2A）、炎症（如STAT1、STAT3和HIF1A）和DNA修复（如DDB2、OGG1和RPA3）相关的通路上调（图2B）。
6. 在NOR阶段，对于上皮层再生至关重要的基底细胞和增殖细胞主要位于上皮-间质交界处附近（图2C和S2C），分别占上皮厚度的6.2%和7.2%（图S2D）。
7. 分化细胞（n = 281,285）具有参与粘膜防御的表达程序（如S100A8、ANXA1和TRIM29），形成保护屏障以抵御外部机械和化学损伤。
8. 这些细胞分散在整个上皮层中（图2C和S2C），平均占总上皮体积的86.7%（图S2D）。

图片说明◉ 图2。食管上皮细胞在整个食管鳞状细胞癌发展过程中的形态和转录进化（A）UMAP图显示了食管上皮细胞亚群（上图），以及不同阶段食管鳞状细胞癌发展中各亚群的比例（下图）。◉ （B）热图显示了不同阶段不同食管上皮细胞亚群中基因的标准化RNA水平（左图），以及气泡图显示了不同食管上皮细胞亚群中每个程序的标准化RNA水平（右图）。◉ （C）食管上皮结构的空间图，显示了上皮细胞之间的相对距离和上皮厚度（上图），以及不同阶段每个食管上皮细胞亚群相对于距离的核密度图（下图）。◉ （D）箱线图显示了不同阶段不同视野中八个程序的表达评分。箱子表示中位数（中央线）和第25至75百分位数（箱体限制），1.5倍四分位范围由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验得到p值。◉ （E）在HGIN中表达评分与上皮-间质界面的相对距离的相关性分析（上图），以及在ESCC中与肿瘤边缘的相对距离的相关性分析（下图）。使用Mann-Kendall趋势检验得到p值和r值。另见图S2。

Para_01

1. 在LGIN阶段，增殖细胞从NOR阶段的7.2%扩展到22.2%（p = 9.7e-7；图S2D），同时伴随着与NOR阶段相比，细胞周期（p = 5.5e-3）、炎症（p = 8.7e-3）和DNA修复（p = 0.017）程序的显著上调（图2D）。
2. 相反，分化上皮细胞的平均比例厚度从NOR阶段的86.7%减少到60.1%（p = 9.7e-7）（图S2D）。
3. 尽管差异不具有统计学意义（p = 0.220；图2D），粘膜防御程序的表达水平也低于NOR阶段。
4. 这些变化表明，LGIN进展的特点是增殖细胞亚群向食管腔方向显著扩张，压缩了分化细胞区域。

Para_02

1. 在HGIN阶段，增殖和侵袭性上皮细胞迁移到了它们的原生区域之外，主导了上皮景观，取代了基底细胞并压缩了分化细胞域（图2C和S2C）。
2. 从增殖细胞中出现侵袭性细胞（n = 58,817）是一个显著事件（图S2B）。
3. 这些细胞表现出上皮间质转化（EMT，例如MMP2、MMP11和CXCL12）、致癌转录因子（TFs，例如SOX2、TP63和TP73）、血管生成（例如SPP1、VEGFA和VEGFC）以及去分化的基因表达显著升高（图2B）。
4. 这种增殖和侵袭性细胞的扩张通过它们在HGIN阶段的平均细胞比例分别为37.3%和18.5%得以证明（图S2E），并且涉及EMT（p = 2.4e-3）、致癌TFs（p = 1.3e-4）和血管生成（p = 5.2e-6）的基因表达水平更高（图2D）。
5. 然而，在这种癌前病变中，分化细胞的平均比例厚度从LGIN阶段的60.1%减少到34.9%（p = 7.1e-3；图S2D），与正常组织相比，粘膜防御程序的表达显著降低（p = 8.3e-6；图2D）。
6. 此外，我们在16个视野中的4个中发现，上皮细胞穿透了上皮-基质界面形成侵袭前沿，尽管其他区域仍然保持完整的界面（图2C）。
7. 在HGIN阶段，侵袭前沿包含比其他区域更高的侵袭性细胞比例（68.5%对比12.3%；图S2F），这表明侵袭性细胞可能在破坏上皮-基质界面中起作用。

Para_03

1. 在ESCC阶段，我们发现基底-间质界面完全破坏，侵袭性细胞亚群的比例显著增加到79.3%，而在HGIN阶段仅为18.5%（p = 7.5e-8；图S2E）。
2. 侵袭性细胞位于肿瘤边缘，并完全侵入间质区域（图2C）。
3. 与HGIN阶段相比，ESCC阶段涉及上皮间质转化（EMT）（p = 9.9e-5）、血管生成（p = 9.3e-3）和去分化（p = 2.3e-5）的基因表达水平显著升高（图2D）。
4. 这些侵袭性特征通过额外的人体组织样本的免疫荧光染色进一步得到证实（图S2G）。
5. 此外，分化细胞主要位于肿瘤核心（图2C），并且其比例从HGIN阶段的29.4%显著下降到ESCC阶段的4.8%（图S2E）。
6. 综合以上结果表明，获得的侵袭性和去分化可能驱动了从LGIN阶段局部扩展到HGIN和ESCC阶段向间质区域的侵袭。

Para_04

1. 此外，我们发现，在HGIN处靠近上皮-间质边界的位置和在ESCC阶段靠近肿瘤边缘的位置，上皮细胞中去分化、细胞周期、EMT和致癌转录因子相关的显著增加趋势（所有p < 2.2e-16；图2E）。
2. 体外侵袭实验表明，与NOR类器官相比，HGIN和ESCC类器官具有显著增强的侵袭能力（p = 0.017 和 p = 8.9e-5），而NOR和LGIN类器官之间的侵袭能力没有显著差异（p = 0.191；图S2H）。
3. 与侵袭能力一致，HGIN和ESCC类器官中侵袭性细胞标记物的水平显著增加，包括EMT通路中的Mmp2和Mmp11、致癌转录因子Nfe2l2、Sox2和Trp63、血管生成因子Vegfa和Vegfc以及去分化的基因Notch1和Col17a1（所有p < 0.05；图S2I）。
4. 这些结果进一步突显了恶性上皮细胞获得侵袭性和去分化的能力，从而推动ESCC的发展。

Epithelial invasiveness and dedifferentiation are indicators of ESCC progression

上皮浸润和去分化是ESCC进展的指标

Para_01

1. 通过使用TF-seqFISH测定方法，我们发现上皮细胞的4个亚群的空间分布和表达模式变化被一致识别（图3A、3B、S3A和S3B）。
2. 然后，我们根据上皮亚群的进化模式开发了独立的上皮侵袭性和去分化评分（见STAR方法，图S3C-S3J）。
3. 在我们的单细胞RNA测序数据中，我们揭示了随着疾病进展到HGIN和ESCC阶段，侵袭性和去分化评分都有显著增加（图3C）。
4. 我们的Xenium原位数据显示，增殖和侵袭性细胞扩张驱动了这一趋势，两者均显示出最高的上皮侵袭性评分，而侵袭性细胞表现出最高的去分化评分（图3D）。
5. 值得注意的是，在NOR/LGIN阶段，增殖细胞的去分化评分低于基底细胞，但在HGIN和ESCC阶段接近基底细胞的数值，这支持了去分化水平是关键进展标志的观点（图3E）。
6. 我们进一步确认，具有相对较高侵袭性和去分化评分的上皮细胞定位在NOR和LGIN阶段的基底层和增殖区，但在HGIN和ESCC阶段扩展至整个病变区域（图3F）。
7. 因此，上皮细胞的中位侵袭性评分从NOR阶段的0.46增加到LGIN、HGIN和ESCC阶段的0.60、0.67和0.69（图3G）。
8. 同时，中位去分化评分在整个ESCC发展中也有所上升（图3G）。
9. 总体而言，这些发现表明食管上皮从分化状态向更去分化和侵袭性状态的转变是ESCC进展的关键指标。

图片说明◉ 图3 肿瘤增殖分化细胞向去分化细胞的转变标志着食管鳞状细胞癌的发展（A）使用TF-seqFISH平台检查的两个组织切片（S47和S48）的DAPI图像（左图）和空间图（右图）。比例尺：100 μm。（B）显示不同上皮细胞亚群中途径基因集富集分析（GSVA）Z分数的散点图。◉ （C）展示scRNA-seq数据中NOR（n = 95）、LGIN（n = 28）、HGIN（n = 1,053）和ESCC（n = 2,002）阶段上皮侵袭评分（上图）和去分化评分表达（下图）的小提琴图。中央线表示中位数。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。（D）展示Xenium In Situ数据中不同阶段不同上皮细胞亚群上皮侵袭评分（上图）和去分化评分（下图）的核密度图。◉ （E）展示所有患者在相关疾病阶段基底细胞、增殖细胞和侵袭细胞去分化评分的小提琴图（上图）。下图描绘了两名单独患者的增殖细胞和基底细胞模式。中央线表示中位数。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。（F）代表性上皮结构的HE染色图像（左图）和空间图（右图）。◉ （G）展示NOR（n = 24）、LGIN（n = 15）、HGIN（n = 16）和ESCC（n = 16）阶段上皮侵袭评分（上图）和去分化评分（下图）的箱线图。箱体表示第25至75百分位数（箱体边界），中位数由中央线表示，须表示1.5倍四分位距范围。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得出p值。另见图S3。

CAF-Epi niche formation by invasive epithelial cells and nearby CAFs from HGIN stage

侵袭性上皮细胞和邻近的CAF形成HGIN阶段的CAF-Epi小生境

Para_01

1. 我们随后使用标记基因PI16、DPT、DCN量化了正常成纤维细胞（NFs）的密度，并使用标记基因FAP、MMP1、MMP11和POSTN在整个疾病连续体中量化了癌相关成纤维细胞（CAFs）的密度（图4A和S4A）。
2. NF密度在LGIN、HGIN和ESCC样本中保持稳定，并广泛分布，在肌肉层中丰富。
3. CAFs密度在NOR（0.12）和LGIN（0.15）中较低，但在HGIN中激增（0.65），并在ESCC中占据主导地位（5.77；图4B）。
4. 此外，我们的结果显示，在ESCC阶段，CAFs距离上皮细胞的平均距离为27.3 μm，显著大于HGIN阶段的20.3 μm（图4C），这表明ESCC阶段扩展的侵袭性上皮细胞可能对将NFs转化为CAFs产生更远和更广泛的效应。
5. 然后，我们在单细胞分辨率下检查了上皮细胞与成纤维细胞之间的空间细胞-细胞相互作用（见STAR方法；图4D）。
6. 我们将距离上皮细胞每10 μm处总成纤维细胞中的CAFs比例进行了比较，并显示当靠近上皮细胞的距离从91-100 μm缩小到1-10 μm时，CAFs的比例显著增加（HGIN阶段p = 2.3e–4，ESCC阶段p = 1.7e–7；图4E）。
7. 此外，使用scRNA-seq数据进行的细胞-细胞通讯分析揭示了从侵袭性上皮细胞到CAFs的相互作用明显强于分化细胞（图S4B）。
8. 这些结果表明，在HGIN阶段出现的侵袭性上皮细胞已经可以激活NFs成为CAFs。

图片说明◉ 图4。侵袭性上皮细胞和附近CAF在HGIN和ESCC阶段形成的CAF-Epi生态位（A）显示标记基因在NFs和CAFs中的标准化RNA水平的点图。（B）显示不同阶段每个视野中NFs和CAFs的平均密度的箱线图。框显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（框限），1.5倍四分位距由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得到p值。（C）显示HGIN和ESCC阶段NFs或CAFs与上皮细胞距离的小提琴图。中心线表示中位数。（D）显示纤维母细胞和上皮细胞空间接近度定量的示意图。（E）显示在HGIN（16个视野）和ESCC（16个视野）阶段通过距离组识别出的NFs和CAFs比例的堆积条形图。Mann-Kendall趋势检验得到p值。（F）显示11种细胞邻域簇中10种细胞类型比例的热图。TLS，三级淋巴结构。（G）代表幻灯片（S1-2）中11种细胞邻域分布的空间图。（H和I）显示不同阶段每个视野中每个细胞邻域簇比例的箱线图。框显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（框限），1.5倍四分位距由须表示。Kruskal-Wallis检验后进行Dunn’s事后检验得到p值。（J）ESCC和HNSC中代表性CAF-Epi生态位的空间地图。另见图S4和表S3。

Para_01

1. 我们随后对整个食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中的细胞群进行了细胞邻域分析。
2. 结果显示了一个由CAFs和侵袭性上皮细胞组成的独特细胞区室，我们将其称为CAFs-上皮（CAFs-Epi）微环境（图4F-4I）。
3. 该微环境在高度异型增生（HGIN）的侵袭前沿和ESCC的肿瘤边缘被识别出来（图4G），在ESCC中观察到的比例显著高于HGIN（p = 7.7e-5）（图4I）。
4. 值得注意的是，微环境内的CAFs表现出更高的激活状态，与外界相比，FAP、MMP11和POSTN的上调显著（所有p < 0.05；图S4C）。
5. 此外，我们还获得了来自头颈鳞状细胞癌（HNSC）样本的Xenium空间数据，发现在肿瘤中有多个CAFs-Epi微环境（图4J）。
6. 这些结果表明，CAFs-Epi微环境的形成可能是鳞状细胞癌（SCC）进展的关键特征。

Invasive epithelial cells drive the CAF-Epi niche formation through JAG1-NOTCH1 signaling

侵袭性上皮细胞通过JAG1-NOTCH1信号传导驱动CAF-Epi微环境的形成

Para_01

1. 我们随后调查了侵袭性细胞与CAFs之间的相互作用如何促进了CAFs-上皮生态位的形成。
2. 在靠近侵袭性细胞的NFs中观察到了CAFs激活标志物（即FAP、MMP1、MMP11和POSTN）表达水平的增加趋势（所有p < 0.001；图S4D），这表明NFs离侵袭性细胞越近，就越有可能被激活为CAFs。
3. 此外，我们发现侵袭性上皮细胞的循环（p < 2.2e–16）和去分化（p < 2.2e–16）程序随着它们与CAFs的空间距离从150 μm减少到1 μm，在ESCC阶段逐步上调（图S4E），包括两个关键基因JAG1（p < 2.2e–16）和NOTCH1（p < 2.2e–16；图S4F）。
4. 共培养永生化食管鳞状细胞系（Het1A）或细胞系（KYSE510）与CAFs显示显著增高的增殖率（分别为p = 6.4e–3和p = 1.8e–6；图S4G）以及NOTCH1、MYC、AURKA、SPP1、SOX2和TP63的表达水平升高（所有p < 0.01；图S4H），相比与NFs共培养的情况。
5. 另一方面，与KYSE510细胞共培养的CAFs表现出显著更高的增殖率（p = 0.019）、迁移能力（p = 0.028）以及CAFs激活标志物（FAP、VIM和αSMA）的蛋白表达水平，相比与Het1A细胞共培养的情况（图S4I-S4K）。
6. 这些结果表明，侵袭性上皮细胞和CAFs的空间共定位在促进和维持CAFs-上皮生态位的形成中起着关键作用，甚至早在HGIN阶段就开始了。

Para_02

1. JAG1和NOTCH1主要在HGIN和ESCC阶段的增殖和侵袭细胞中表达（图S5A）。
2. JAG1与NOTCH1的结合导致了NOTCH1胞内域（NICD）的释放，这促进了趋化因子下游转录的激活，可能促进NFs的募集和激活。
3. 我们的先前单细胞转录组研究揭示，在食管样本中，三种趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20相对高表达，并且在HGIN阶段上皮细胞中的表达显著上调（p = 7.1e-4、1.9e-3和3.4e-3，分别）以及在ESCC阶段（p = 1.3e-4、2.1e-3和1.8e-3，分别）相比NOR（图S5B）。
4. 在这三种趋化因子中，只有CXCL1和CXCL8（而不是CCL20）在JAG1扰动后显著改变（图S5C-S5F）。
5. 共免疫沉淀产物的western blotting验证表明，在ESCC细胞中，JAG1过表达后，NICD1与其辅助因子CSL的结合显著增加（图S5G）。
6. 染色质免疫沉淀耦合定量PCR分析显示，在KYSE510细胞中，JAG1过表达显著增强了NICD1与CXCL1（p = 0.008）和CXCL8（p = 0.025）启动子的结合，与对照组相比。

Para_03

1. 我们随后检查了上皮JAG1-NOTCH1信号传导在ESCC发展过程中招募和激活CAFs的效果。
2. 多重免疫荧光分析显示，在ESCC发展中JAG1水平增加，得分与ESCC癌巢或邻近间质的上皮层中的CAF标记物αSMA（r = 0.57，p = 7.3e-14）和FAP（r = 0.53，p = 6.1e-12）呈正相关，这与Xenium In Situ数据一致（图5A和S5I）。
3. 我们的小鼠食道scRNA-seq分析显示，用致癌物4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）处理的小鼠食道诱导了多阶段ESCC病变，也揭示了JAG1表达和CAF评分（Acta2、Mmp11和Cthrc1）之间存在相关性（r = 0.66，p = 0.024），并且在ESCC发展中呈现上升趋势（图5B和5C）。
4. 此外，来自人食道组织的空间转录组数据显示，在ESCC进展过程中，上皮细胞附近的CAF评分升高（图5D）。
5. 因此，我们将ESCC细胞与从人食道组织中提取的NFs共培养，结果显示，与控制ESCC细胞共培养的NFs相比，与JAG1过表达的ESCC细胞共培养的NFs表现出显著更高的迁移能力（p = 1.2e-14），而当NFs与JAG1沉默的ESCC细胞共培养时，结果相反（p = 3.7e-13和p = 9.2e-13；图S6A）。
6. 有趣的是，当在JAG1过表达的ESCC细胞中敲低CXCL1或CXCL8时，共培养的NFs的迁移能力不再增加（图S6B）。
7. CAF活化标记物（胶原I、FAP、αSMA和IL6）在与JAG1过表达的ESCC细胞共培养的NFs中升高，而在与JAG1沉默的ESCC细胞共培养的NFs中保持不变，与对照组相比（图S6C）。
8. 综合来看，这些结果表明，上皮细胞中升高的JAG1-NOTCH1信号传导在招募和激活CAFs中起重要作用。

图片说明◉ 图5。JAG1-NOTCH1信号通路促进癌症相关成纤维细胞的招募和激活(A) 多重免疫荧光分析（左图）和空间转录组学图谱（右图）显示了不同阶段的JAG1和CAF活化标志物FAP和αSMA。◉ (B) 线图显示NOR（n = 3）、LGIN（n = 2）、HGIN（n = 2）和ESCC（n = 4）各阶段的Jag1 RNA水平和CAF评分趋势。数据显示中位数。◉ (C) 鼠类scRNA测序数据中Jag1水平与CAF评分之间的斯皮尔曼相关性（C）。通过斯皮尔曼相关性检验得到p值和r值。◉ (D) 代表性NOR、LGIN、HGIN和ESCC区域的空间图显示HE染色（左图）和CAF评分水平（右图）。比例尺：500 μm。◉ (E) 遗传工程小鼠食管上皮特异性Notch1条件敲除诱导食管前癌病变和ESCC的示意图（上图）和HE图像（下图）。比例尺：1,000 μm。◉ (F) 条形图显示按基因型划分的LGIN、HGIN和ESCC网格比例（每组n = 5）。数据为平均值 ± SEM。通过Kruskal-Wallis检验后进行Dunn's事后检验得出p值。◉ (G) 在不同阶段的鼠食管样本中对NICD、JAG1和CAF活化标志物FAP和αSMA进行多重免疫荧光分析。比例尺：100 μm。◉ (H) 线图（左上图）显示Notch1+/+小鼠在NOR（n = 4）、LGIN（n = 7）、HGIN（n = 6）和ESCC（n = 4）各阶段的NICD、JAG1、FAP和αSMA表达水平的趋势及斯皮尔曼相关性（右上图）显示增殖和CAF评分之间的关系。通过斯皮尔曼相关性检验得到p值和r值。◉ 条形图（下图）显示Notch1+/+（n = 6）、Notch1+/−（n = 10）和Notch1−/−（n = 6）小鼠食管样本中的NICD、JAG1、FAP和αSMA的IF评分。数据为平均值 ± SEM。通过Kruskal-Wallis检验后进行Dunn's事后检验得出p值。参见图S5和表S3。

Para_03

1. 我们建立了食管上皮特异性Notch1敲除小鼠，并用4-NQO处理以诱导多阶段ESCC病变（见STAR方法）。
2. 我们将小鼠食管组织的苏木精和伊红染色切片分区，并将其划分为100微米乘100微米的区域，以定量评估每只小鼠（n = 5；图5E和S6D）中各种病变的比例。
3. 在小鼠中删除Notch1导致ESCC病变发生率显著降低，Notch1⁻/⁻小鼠显示出最少的侵袭性区域（图5F）。
4. 多重免疫荧光确认了上皮Notch1信号促进CAF激活，因为JAG1和NICD1水平随着疾病进展逐步增加，并且与CAF标记物（FAP和αSMA）呈正相关（图5G、5H和S6D–S6F）。
5. 我们还建立了由4-NQO诱导的Notch1条件敲除小鼠中的ESCC来源的类器官，并通过多重免疫荧光和qPCR分析发现Notch1+/−（p = 1.0e-11和p = 0.002）和Notch1−/−（p < 2.2e-16和p = 4.8e-6）小鼠中的Cxcl1水平显著低于Notch1+/+小鼠（图S6G和S6H）。
6. 总之，这些发现强烈表明CAF-Epi生态位的形成驱动ESCC进展，而JAG1-NOTCH1信号抑制可防止其发展。

The CAF-Epi niche forms an immune-sequestration microenvironment in the tumor region

CAF-Epi 小生境在肿瘤区域形成免疫隔离微环境

Para_01

1. 为了阐明CAF-Epi生态位形成的免疫后果，我们系统地分析了ESCC进展过程中上皮和间质区域免疫细胞的空间分布（图6A-6C和S7A-S7C）。
2. 在上皮-间质交界线以上的上皮区域，我们观察到单核细胞密度略有增加（0.61对1.00，p = 0.381），树突状细胞（0.12对0.52，p = 0.177）以及CD8+和CD4+初始/记忆T细胞（0.61对0.83，p = 0.115和0.55对0.79，p = 0.060）从NOR到LGIN阶段有所增加（图6A、6C和S7C）。
3. 在间质区域，除三级淋巴结构（TLS）的比例有所增加外，免疫细胞密度没有显著变化，从NOR阶段的45个视野中的12个（26.7%）增加到LGIN阶段的25个视野中的9个（36.0%）。
4. 这些结果表明，在NOR和LGIN阶段存在一种积极的免疫反应，旨在抵御ESCC的进展。

图片说明◉ 图6。CAF-Epi小生境的形成建立了肿瘤区域中的免疫隔离微环境（A）散点图显示了不同阶段每个视野上皮区（上图）和间质区（下图）中免疫细胞亚型的平均密度。（B）热图显示了不同距离到上皮-间质界面（HGIN）或肿瘤边缘（ESCC）的CAFs和SPP1+巨噬细胞（上图），CD8+和CD4+T细胞（下图）的平均密度。左图来自HGIN阶段，右图来自ESCC阶段。（C）代表CAF-Epi小生境和不同类型免疫细胞分布的空间图。（D和F）ECM评分与ESCC（D）和HNSC（F）样本中肿瘤边缘距离的相关性分析。左图显示了ECM评分和CAF-Epi小生境的空间图。右图是ECM评分与肿瘤边缘距离之间的相关曲线。p值和r值通过Mann-Kendall趋势检验。（E和G）ESCC（E）和HNSC（G）样本的HE染色和多重免疫荧光图像，显示EPCAM、CAF激活标志物αSMA和FAP以及ECM成分I型胶原和III型胶原。比例尺，500μm。另见图S6和S7以及表S3。

Para_01

1. 在HGIN阶段的上皮区域，CD4+调节性T细胞（Tregs）的密度显著升高，与正常组织（NOR）相比（0.77比0.08，p = 3.9e-7），增殖评分也显著增加（通过平均MKI67、AURKA、CCDN1和CCNA2的表达水平；p = 2.2e-5；图6A、6C、S7C和S7D）。
2. 相比之下，与正常组织（NOR）相比（0.43比0.61，p = 0.018；图6A、6C和S7A），HGIN阶段的CD8+幼稚/记忆T细胞密度降低。
3. 此外，与正常组织阶段（NOR）的0.02相比，HGIN阶段上皮区域内的肿瘤促进SPP1+巨噬细胞的密度增加（0.19，p = 5.6e-5），并且增殖评分也有显著增加（p = 0.016；图6A、6C、S7C和S7D）。
4. 在HGIN阶段的间质区域，TLS的存在比例增加（15/21个视野，71.4%）与低级别上皮内瘤变（LGIN）的36.0%和正常组织（NOR）的26.7%相比。
5. 这些发现表明，尽管免疫反应在HGIN阶段是活跃的，但在这一晚期癌前阶段，上皮区域可能开始出现向免疫抑制的转变，并且伴随巨噬细胞向促肿瘤表型的分化。

Para_02

1. 在ESCC中，观察到了免疫细胞分布更加剧烈的变化。
2. 与正常组织（NOR）相比，ESCC阶段肿瘤区域的CD4+和CD8+幼稚/记忆T细胞以及树突状细胞密度显著降低（0.55比0.24，p = 0.001；0.62比0.08，p = 2.6e-7；0.12比0.03，p = 0.003；图6A、6C和S7C所示）。
3. 此外，我们注意到ESCC阶段肿瘤区域的CD8+ Tex细胞密度显著升高（0.33比0.10，p = 0.004），增殖分数也显著增加（p = 0.043；图6A、6C、S7C和S7D所示）。
4. 此外，ESCC阶段肿瘤区域内的SPP1+巨噬细胞密度显著增加至0.65（p = 4.0e-13），而正常组织中仅为0.02，同时增殖分数也显著提高（p = 0.004；图6A、6C、S7C和S7D所示）。
5. 这些发现表明，在晚期ESCC阶段建立了一个免疫抑制和耗竭的微环境，这伴随着肿瘤区域巨噬细胞向促肿瘤分化的发展。

Para_03

1. 我们随后调查了免疫变化是否与CAF-Epi生态位的形成有关。
2. 细胞邻域分析显示，在食管鳞状细胞癌（ESCC）阶段，SPP1阳性巨噬细胞和CAF-Epi生态位在肿瘤区域显著共定位（图S7E）。
3. 此外，使用单细胞RNA测序数据分析发现，CAF与SPP1阳性巨噬细胞之间增强了极化或粘附相关的配体受体对，包括先前已知的RARRES2-CMKLR1,47,48,49，而与正常纤维细胞（NFs）和SPP1阳性巨噬细胞相比（图S7F）。
4. 这些结果表明，CAF-Epi生态位的形成可能促进SPP1阳性巨噬细胞在从高度异型增生（HGIN）到ESCC阶段过渡期间的分化。

Para_04

1. 此外，细胞密度分析显示，在高度异型增生（HGIN）和食管鳞状细胞癌（ESCC）中，上皮-间质交界处周围富集了CAF-Epi生态位和SPP1阳性巨噬细胞，并且在ESCC中CAF和SPP1阳性巨噬细胞的密度更高（图6B和6C）。
2. 在HGIN中，CD4+和CD8+T细胞（不包括CD4+调节性T细胞）的密度在上皮区域以及距离上皮-间质交界处100微米内的区域显著低于在超过100微米的间质区域（图6B）。
3. 而在ESCC中，在肿瘤区域内以及超出肿瘤边界250微米范围内识别出一个免疫空洞区（图6B）。
4. 这些空间分布表明，肿瘤边缘的CAF-Epi生态位可能形成了一道屏障，损害了肿瘤防御中的免疫细胞功能。
5. 因此，我们研究了这种屏障是否由CAF-Epi生态位形成过程中诱导的细胞外基质（ECM）重塑所导致。
6. 我们发现，在肿瘤边缘CAF-Epi生态位周围的高ECM评分（通过COL1A1、COL1A2和COL3A1表达的平均值计算得出）有所增加（图6D）。
7. 在间质区域，我们观察到随着接近肿瘤边缘的距离从0到250微米，ECM评分显著下降（r = -0.86, p < 2.2e-16；图6D）。
8. 在上皮区域，随着接近肿瘤边缘的距离从0到50微米，也观察到了类似的下降趋势（r = -0.53, p = 3.2e-8；图6D）。
9. 这些结果表明，在肿瘤边缘CAF-Epi生态位周围形成了密集的纤维化ECM。
10. 此外，通过多路免疫荧光分析确认了上皮细胞（EPCAM）、CAF（FAP和αSMA）以及ECM（I型胶原和III型胶原）标记基因，进一步证实了这一ECM重塑现象（图6E）。
11. 此外，我们在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）中也发现了类似的CAF-Epi生态位以及它诱导的ECM重塑（图6F和6G），这表明这种生态位通过ECM重塑促进在多种鳞状细胞癌中建立免疫隔离微环境。

Clinical potential of epithelial and microenvironmental remodeling scores in ESCC and other SCC

上皮和微环境重塑评分在ESCC及其他SCC中的临床潜力

Para_01

1. 我们随后系统地评估了CAF-Epi生态位在ESCC发展中的临床相关性。
2. 我们通过平均FAP、MMP1、MMP11、POSTN、COL1A1、COL1A2和COL3A1的表达水平得出了一个CAF评分，并测试了其预测价值，独立于或与已建立的上皮侵袭评分结合，用于ESCC进展的预测（图7A）。
3. 上皮侵袭评分在NOR时为0.70，在HGIN时显著增加至0.82（p = 4.4e-10），在ESCC时进一步增加至0.98（p < 2.2e-16；图7B）。
4. CAF评分在NOR和LGIN时分别为1.09和1.12。
5. 与NOR相比，该评分在HGIN时显著增加至1.31（p = 0.003），并在ESCC时进一步增加至1.62（p = 3.0e-10；图7B）。
6. 值得注意的是，整合的CAF-Epi生态位评分结合了上皮侵袭评分和CAF评分，在NOR（0.85）、HGIN（1.02，p = 5.3e-8）和ESCC（1.15，p < 2.2e-16；图7B）中显示出递增趋势。
7. 此外，我们发现JAG1的表达水平与CAF评分之间存在显著相关性（r = 0.16，p = 0.024；图S7G），证实了CAF激活是由JAG1-NOTCH1信号驱动的。
8. 利用多路免疫荧光分析在额外队列中，我们确认了ESCC（n = 48）、HNSC（n = 66）、肺鳞状细胞癌（LUSC，n = 80）和宫颈鳞状细胞癌（CESC，n = 94；图7C）样本中CAF-Epi生态位的形成。
9. 综上所述，与CAF-Epi生态位形成相关的基因可能作为多种SCC进展的重要指标。

图片说明◉ 图7。上皮侵袭性和CAF评分与ESCC进展和pan-SCC预后相关（A和B）显示与侵袭性细胞和CAFs相关的基因蛋白表达水平的热图（A）以及展示上皮侵袭性评分、CAF评分和CAF-Epi生态位评分在蛋白水平上的箱线图（B），样本分别处于NOR（n = 114）、LGIN（n = 206）、HGIN（n = 259）和ESCC（n = 207）阶段。箱形图显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（箱体界限），用1.5倍四分位范围表示的须。p < 0.05；p < 0.01；p < 0.001；p值由Kruskal-Wallis检验后进行Dunn事后检验得出。（C）ESCC、HNSC、LUSC和CESC样品中标记基因的多光谱免疫荧光：CAFs（FAP和αSMA）和侵袭性上皮细胞（JAG1和EPCAM）。比例尺，100 μm。（D）基于CAF-Epi-Immune评分的训练队列（左面板，n = 179）、验证队列（中面板，n = 137）和联合队列（右面板，n = 316）中ESCC患者的总体生存率Kaplan-Meier曲线。根据CAF-Epi-Immune评分的中位数将患者分为高表达组和低表达组。p值通过对数秩检验得出。风险比（HR）使用Cox回归估计，并给出95%置信区间（CI）。（E）根据TNM分期对ESCC联合队列（n = 316）中ESCC患者的危险评分。箱形图显示中位数（中央线）和第25至第75百分位数（箱体界限），用1.5倍四分位范围表示的须。p值通过双侧t检验得出。（F和G）来自TCGA数据库的SCC患者的总体生存率Kaplan-Meier曲线（F），包括TCGA-HNSC队列（左面板，n = 545）、TCGA-LUSC队列（中面板，n = 542）和TCGA-CESC队列（右面板，n = 296）以及联合SCC队列（G，n = 1,699）。根据CAF-Epi-Immune评分的中位数将患者分为高表达组和低表达组。p值通过对数秩检验得出。HR使用Cox回归估计，并给出95% CI。另见图S7。

Para_01

1. 我们接下来研究了CAFs-上皮细胞（CAFs-Epi）微环境在鳞状细胞癌（SCC）中的预后潜力及其诱导的免疫微环境重塑。
2. 我们通过最小绝对收缩和选择算子（LASSO）Cox回归分析了179名食管鳞状细胞癌（ESCC）患者的36个与预后相关的细胞基因，构建了一个预后预测模型（发现队列；图S7H），确定了一个由26个基因组成的"CAFs-Epi-免疫"评分，该评分与ESCC的预后密切相关（p = 0.046；图7D）。
3. 在独立的137名ESCC患者队列（验证队列）中进一步确认了这一评分的预后效用，结果显示评分较高与较差的总体生存率相关（p = 5.7e–8；图7D）。
4. 当将发现队列和验证队列合并后，在316名ESCC患者中观察到类似的趋势（p = 3.4e–7；图7D），并且较高的评分与更晚期的肿瘤-淋巴结-转移（TNM）分期（III和IV期）相比早期阶段（I和II期）的相关性更强（p = 2.0e–8；图7E）。
5. 与单独的上皮侵袭评分（0.747）或CAFs评分（0.720）相比，CAFs-Epi-免疫评分在ESCC患者预后预测中的曲线下面积（AUC）更高（0.786；图S7I）。
6. 尽管这一评分的AUC高于TNM（0.786比0.722；图S7I），但在对数似然比检验中并未显示出超出TNM的额外预后价值（p = 0.085），这表明它主要反映了ESCC的进展。
7. 我们还评估了这一评分在癌症基因组图谱（TCGA）数据库中其他类型SCC中的预后价值，包括头颈鳞状细胞癌（HNSC，n = 545）、肺鳞状细胞癌（LUSC，n = 542）和宫颈鳞状细胞癌（CESC，n = 296）。结果显示，评分较高与HNSC（p = 0.003）、LUSC（p = 0.025）和CESC（p = 6.7e–5；图7F）的不良预后显著相关。
8. 在对1,699份SCC样本的综合分析中，我们进一步证实了高评分与较差预后风险增加之间的显著关联（HR = 1.74，95% CI：1.60–1.89，p = 2.4e–9；图7G）。这些发现突显了CAFs-Epi微环境在泛SCC中的潜在预后意义。

Discussion

Para_01

1. 空间转录组学通过整合定义形态内的高通量分子数据，彻底改变了肿瘤生态系统的研究。
2. 然而，以前的技术面临分辨率挑战，通常会捕捉到多个细胞群体的信号。
3. 在这里，我们应用了两种先进技术来解读食管鳞状细胞癌的肿瘤发生过程，揭示了关键的细胞相互作用和进化轨迹。
4. 一个重要的发现是，JAG1-NOTCH1驱动CAF-Epi生态位的形成，这重塑了肿瘤微环境，并促进了免疫逃逸。

Para_02

1. 先前的研究表明，食管鳞状细胞癌可能起源于基底层中平衡偏向于增殖而非分化的食管上皮祖细胞。然而，缺乏直接的人体组织证据。我们的多阶段空间进化图鉴定了在食管鳞状细胞癌发展过程中发挥不同作用的四种上皮细胞亚群。从正常到低级别上皮内瘤变，增殖细胞向管腔扩展，同时保持上皮结构。在高度不典型增生中，侵袭性细胞出现，突破上皮-间质界面，并获得多种癌症特征。此外，这些细胞的分化程度低于低级别上皮内瘤变的增殖细胞，类似于基底细胞，这表明肿瘤进展是由去分化或干细胞样群体的选择驱动的。上皮细胞的进化及其异常相互作用也可能由TP53失活及其诱导的基因组改变驱动，这些改变在关键的癌症相关通路（如细胞周期、上皮-间质转化和致癌转录因子）中引发级联效应。

Para_03

1. 上皮细胞与成纤维细胞的相互作用是CAF-Epi微环境形成的核心。
2. 我们之前的单细胞RNA测序分析表明，在HGIN和ESCC阶段，转化的上皮细胞可以通过减弱的串扰激活NFs成为CAFs。
3. 虽然已经提出了这种过程的遗传驱动因素，但上皮细胞在ESCC发展中招募和激活NFs/CAFs的空间范围和详细机制仍然未知。
4. 在这里，我们提供了直接证据，证明从HGIN阶段开始就存在CAF-Epi微环境，在此过程中破坏上皮基质边界使侵袭性上皮细胞和CAF相互作用。
5. 值得注意的是，JAG1-NOTCH1及其下游的CXCL1和CXCL8介导了上皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用和共同进化。
6. 此外，CAF-Epi微环境可能促进CD4+ Tregs和SPP1+巨噬细胞的分化，从而在HGIN和ESCC阶段促进免疫抑制。
7. 肿瘤边缘CAF-Epi微环境的形成还诱导ECM重塑，这建立了一道阻碍免疫细胞防御肿瘤能力的屏障。
8. 值得注意的是，我们在多种SCCs中发现了CAF-Epi微环境的存在，这表明存在一种泛SCC免疫逃逸机制，并代表了肿瘤‘最后一道防线’的丧失。

Para_04

1. 重要的是，我们的研究发现具有重要的临床应用潜力。
2. 目前，食管鳞状细胞癌（ESCC）和前体病变的诊断依赖于内镜检查和组织病理学，但这种方法未能充分捕捉疾病进展，并缺乏预后精确性。
3. 我们的研究发现表明，一个综合的CAF-Epi-免疫评分，反映了侵袭性、去分化表型的同时获得以及基质-免疫改变，可以作为ESCC进展的指标，并与ESCC和其他SCC患者的预后相关。
4. 这些发现突显了将CAF-Epi生态位评估整合到SCC临床评估中的必要性。

Para_05

1. 总之，本研究描绘了食管鳞状细胞癌（ESCC）发展过程中多阶段的空间细胞演变和分子机制轮廓，阐明了JAG1-NOTCH1驱动的上皮重塑和CAF招募作为CAV-上皮生态位形成的关键过程。
2. 这些见解显著推进了我们对鳞状细胞癌发生机制的理解，强调了CAV-上皮生态位在未来临床评估中的重要性。

Limitations of the study

研究的局限性

Para_06

1. 本研究设计的基因面板主要是为了表征上皮细胞的进化及其与基质细胞的相互作用。
2. 未来的研究应该扩大所考察的基因范围，以全面探索其他细胞群和亚群的进化和相互作用。
3. 此外，鉴于从同一受试者收集多阶段食管组织用于肿瘤发生研究的挑战和重要性，未来的研究应扩展多组学方法并增强时间分辨率。
4. 这一改进将有助于更详细地了解食管癌发生的时空过程。
5. 在我们的体外分析中，我们使用FAP和ACTA2（αSMA）作为肌成纤维细胞活化的标志物，这两种标志物在ESCC中的肌成纤维细胞中高度表达。
6. 然而，需要注意的是，iCAFs和周细胞也表达了不同水平的ACTA2，现有研究表明FAP和αSMA并不总是由CAFs共同表达。

Resource availability

Lead contact

主要联系人

Para_01

1. 进一步的信息和资源及试剂的需求应联系主要联系人陈武（chenwu@cicams.ac），并将由其满足。
2. ,

Materials availability

材料可用性

Para_01

1. 本研究没有产生新的独特试剂。

Data and code availability

数据和代码可用性

Para_01

1. 本研究没有生成任何算法或软件。可以在 GitHub () 上获取用于重现主要图表的代码。如有必要重新分析本文报告的数据，请联系主要联系人。
2. 任何重新分析本文报告数据所需的附加信息均可根据请求从主要联系人处获得。

Acknowledgments

Para_01

1. 作者感谢所有参与林州食管癌医院研究的患者和医生。
2. 该项目得到了中国国家自然科学基金（资助编号81988101，授予D. Lin和C.W.）的支持。
3. 国家重点研发计划（资助编号2021YFC2502000，授予J.C.）也为本项目提供了资助。
4. 中国医学科学院医学与健康科技创新项目（资助编号2021-I2M-1-013、2022-I2M-2-003、2023-I2M-QJ-002和2024-I2M-zd-003，授予D. Lin；资助编号2021-I2M-1-013、2023-I2M-2-004和2023-I2M-QJ-005，授予C.W.）也对该研究给予了支持。
5. 此外，国家自然科学基金（资助编号32370699和32170652，授予A.E.T.）也为本研究提供了资金。
6. 同时，作者还感谢了通过XPLORER奖的基石科学基金会提供的支持。

Author contributions

Para_01

1. C.W.、J.C.、X.W.、A.E.T.和D.林构思、监督并为研究筹集资金。
2. C.W.、X.W.和J.C.负责项目管理和收集研究资源。
3. J.陆、Q.L.、T.L.、Cainan李、S.Y.、J.李、Chenying李、P.W.、H.Y.和X.X.参与了样本采集和数据整理。
4. X.C.、S.Z.、Z.L.、Q.L.、T.X.、L.H.、H.Y.、G.C.、L.Z.、F.Q.和D.W.进行了大部分空间转录组实验和功能实验。
5. J.C.、A.E.T.、J.陆、Q.L.、Y.Y.、D.李、T.L.、X.C.、S.Z.、M.W.和H.D.进行了正式分析和数据可视化。
6. J.C.和J.陆起草了手稿，A.E.T.、X.W.、D.林和C.W.审阅并准备了最终的手稿。
7. 所有作者均批准了该手稿。

Declaration of interests

Para_01

1. 作者声明不存在竞争性利益。

STAR★Methods

Key resources table

关键资源表

Experimental model and study participant details

实验模型和研究参与者详情

Human tissue sample collection

人体组织样本采集

Para_01

1. 食管组织样本于2020年至2023年期间从河南省林州市食管癌医院收集，用于空间转录组学分析（n = 43，表S1）。
2. 该研究获得了中国医学科学院肿瘤医院伦理审查委员会的批准（20/069-2265和23/305-4047）。
3. 参与本研究的患者在手术前未接受化疗或放疗。
4. 所有患者均签署了知情同意书，并从病历中收集了相关的临床信息。

Establishment of esophageal epithelium-specific Notch1 knockout mouse model

建立食管上皮特异性Notch1敲除小鼠模型

Para_01

1. 鼠类实验遵循中国医学科学院动物护理和使用委员会的规程。
2. C57BL/6Smoc-Notch1em1(flox)Smoc小鼠由中国南京大学模式动物研究中心提供。
3. 这些小鼠与ED-L2-Cre小鼠交配，以生成食管上皮Notch1同源敲除（Notch1−/−: ED-L2-Cre; Notch1L/L）、杂合敲除（Notch1+/−: ED-L2-Cre; Notch1L/WT）和野生型（Notch1+/+: Notch1L/L）小鼠的基因工程小鼠模型（GEMMs）。
4. 通过表S3中详述的引物进行PCR验证小鼠的基因型。
5. GEMMs在本地饲养设施中维持在受控条件下（温度23 ± 1°C，湿度50 ± 10%，12小时光照-12小时黑暗循环）。

Establishment of mouse esophageal organoids

小鼠食道类器官的建立

Para_01

1. 食管上皮从C57BL/6小鼠在4-硝基喹啉1-氧化物（4-NQO）处理后的食管癌发展四个不同疾病阶段分离出来，并且从Notch1+/+、Notch1+/−和Notch1−/−小鼠在4-NQO处理后26周的食管中分离出来。
2. 根据先前描述的方案建立了来自食管癌发展四个不同疾病阶段的类器官以及GEMM衍生的小鼠的类器官。
3. 简而言之，食管上皮被消化并过滤。
4. 细胞悬液与250 μL稀释的生长因子减少的Matrigel（354230，Corning）混合后，在24孔板中接种。
5. 培养基每3天更换一次。
6. 类器官每5天传代一次。
7. 为了进行组织病理学检查，收集并解离类器官，将其在37°C下用TrypLE孵育15分钟。
8. 固定后，类器官被制备成FFPE切片用于苏木精和伊红染色。

Establishment of cell lines with altered JAG1 expression

具有改变的 JAG1 表达的细胞系的建立

Para_01

1. 永生化正常食管上皮细胞系Het1A来自美国典型培养物保藏中心。
2. ESCC细胞系KYSE510是日本兵库医科大学Shimada博士的友好馈赠。
3. 所有细胞系均通过DNA指纹分析进行鉴定，并检测未感染支原体。
4. 为了进行瞬时JAG1敲低，Het1A和KYSE510细胞使用Lipofectamine 2000（11668027，Invitrogen）根据制造商的方案进行瞬时转染。
5. 为了建立异位过表达JAG1的细胞系，JAG1（NM_000214）编码序列被克隆到GV341载体（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin）中。
6. JAG1的过表达通过Western印迹和qRT-PCR检测确认。
7. siRNA和qRT-PCT引物序列如表S3所示。

Method details

方法细节

Sample processing and panel design for spatial transcriptomic profiling

空间转录组学分析的样本处理和面板设计

Para_01

1. 每种组织依次被切片，每种组织切成4到6层，间隔200微米，从而能够重建整个组织结构的三维图像，并在每一层捕捉连续的多阶段样本。
2. 组织样品立即被嵌入到冷却的最优切割温度（OCT，4583，Sakura）中，并同时在干冰上冷冻至少30分钟。
3. 含有OCT的组织块使用低温恒温切片机（Leica CM1950 S）在−20°C下切成10微米的切片，用于HE染色。
4. 两位病理学家独立根据《消化系统肿瘤WHO分类第五版》对HE染色切片进行了组织病理学审查。
5. 组织块储存在−80°C直到使用。

Para_02

1. 每个样本进行了空间转录组学分析，并通过相邻组织层的苏木精和伊红（H&E）染色进行了组织病理学评估。
2. 使用Xenium In Situ和TF-seqFISH技术进行的空间转录组学分析采用了定制的基因面板来忠实检测原位基因表达。
3. Xenium In Situ使用的包含300个基因的基因面板（表S2）涵盖了11条关键的致癌途径，并识别了微环境中8个不同细胞群体的标记物，而TF-seqFISH使用的包含1,471个基因的基因面板（表S2）是基于先前研究中发布并通过MSigDB（版本6.2）和CancerSEA数据库注释的单细胞和空间转录组学数据设计的。
4. 具体而言，这两个平台涵盖了与关键功能途径相关的基因，包括血管生成（n = 65）、细胞周期（n = 141）、细胞代谢（n = 117）、去分化（n = 113）、DNA修复（n = 219）、上皮间质转化（n = 189）、缺氧（n = 66）、炎症（n = 110）、表观遗传重编程（n = 5）和粘膜防御（n = 217）以及致癌转录因子（n = 22）。
5. 基因探针序列是根据GRCh38参考基因组（基因组参考联盟人类构建38）选择的。

Xenium In Situ spatial transcriptomic profiling

Xenium 原位空间转录组分析

Para_01

1. Xenium In Situ载玻片（n = 56）是根据制造商的指示和工作流程为新鲜冷冻样本准备的（PN-1000465，CG000579 Rev D，10x Genomics）。
2. 简而言之，将选定组织区域的10微米切片小心地固定在Xenium载玻片样本区域的框架内。
3. 干燥后，载玻片在多聚甲醛（PFA）溶液中固定，并在70％乙醇中透化。
4. 然后组装Xenium盒（CG000581 Rev C），并进行探针杂交、连接和扩增（CG000582 Rev D）。
5. 通过自动荧光淬灭和细胞核染色，使用Xenium分析仪（PN-1000481和PN-1000569）捕获并分析组织图像。
6. 感兴趣区域从扫描图像中手动选择。
7. 每个载玻片的运行后数据使用默认参数用于下游分析。

TF-seqFISH spatial transcriptomic profiling

TF-seqFISH空间转录组学分析

Para_01

1. TF-seqFISH实验（n = 2）按照Zhong等人的方法进行。81
2. 简而言之，将6微米厚的组织切片固定在超洁净盖玻片上，在4％多聚甲醛（F9027，Sigma）中固定，并在4℃下用70％乙醇（89125-186，KOPTEC，VWR）透化。
3. 随后，将切片在37℃下进行探针杂交（探针溶液：每种1纳摩尔）12至48小时。
4. 为了进行组织透明化处理，将切片嵌入到丙烯酰胺/双丙烯酰胺水凝胶（1610154，Bio-Rad；50640，Lonza）中，并使用蛋白酶K（P8107S，NEB）消化。
5. DAPI染色后，用水凝胶切片通过盘形成像系统（Dragonfly 500，Andor Technology Ltd）在405（细胞核），488，637和594通道进行成像，共进行了22次杂交成像循环。
6. 对多通道图像进行了以前描述过的细胞分割、条形码调用和表达定量处理。81

Raw transcriptomic profiling data processing

原始转录组学数据处理

Para_01

1. 原始数据由Xenium Ranger使用默认参数（版本1.7.0，10x Genomics）处理。
2. 使用Seurat包（版本5.0.0）在R（版本4.3.1）中对原始计数矩阵进行了预处理。
3. 在质量控制中，保留了基因表达≥1的细胞。
4. 使用SCTransform函数基于正则化负二项回归对原始计数数据进行了标准化。
5. 使用runPCA函数进行了降维，并通过ElbowPlot函数选择了主成分的最佳数量。
6. 使用FindClusters函数确定了细胞簇，并通过UMAP降维可视化了这些簇。

Cell population and subpopulation annotations

细胞群体和亚群注释

Para_01

1. 我们根据先前描述的已知标记基因的表达情况，标注了8个主要细胞群，即上皮细胞的EPCAM、SFN、KRT4和KRT5；成纤维细胞的DCN、COL1A1、COL1A2和COL3A1；内皮细胞的VWF、PECAM1、ENG和CDH5；T细胞的CD2、CD3D和CD3E；B/浆细胞的CD19、CD79A、MS4A1、JCHAIN和IGHG2；髓系细胞的CD68、LYZ、CD14、FCGR3A和CPA3；肌细胞的PLN、MYH11、ACTG2、CNN1、MYL9和TAGLN；腺体细胞的AGR2、KRT23和WFCD2。
2. ,

Para_02

1. 标准化后的上皮细胞计数被提取并用于 scVI 工作流程（版本 1.0.3）进行批次效应消除。
2. 基于 Leiden 的聚类根据标记基因表达的相似性进行了合并。
3. 上皮细胞的四个亚群被分类为基底细胞（COL17A1 和 NOTCH1）、增殖细胞（MKI67 和 JAG1）、分化细胞（ANXA1 和 ECM1）和侵袭细胞（SOX2、NFE2L2、SPP1 和 MMP11）。
4. 成纤维细胞亚群根据无监督聚类和标记基因表达进行注释：IGFBP6、PI16、DPT、CXCL12、GPX3 和 DCN 用于正常成纤维细胞（NFs），FAP、MMP1、MMP11 和 POSTN 用于癌症相关成纤维细胞（CAFs）。
5. T 细胞根据 CD3 基因（CD3D 和 CD3E）、CD8 基因（CD8A 和 CD8B）和 CD4 的平均表达量被分离为 CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞。
6. 对于 CD8+ T 细胞，幼稚/记忆 T 细胞（TCF7、CCR7 和 SELL）、效应 T 细胞（CD8+ Teff、GZMB、GZMA、GZMH、NKG7 和 GNLY）和耗竭 T 细胞（CD8+ Tex、PDCD1、CXCL13、CTLA4 和 HAVCR2）被注释；
7. 对于 CD4+ T 细胞，幼稚/记忆 T 细胞（TCF7、CCR7 和 SELL）、滤泡辅助 T 细胞（CD4+ Tfh、CXCL13 和 CD200）和调节性 T 细胞（CD4+ Treg、FOXP3、IL2RA 和 CTLA4）被注释。
8. 内皮细胞被注释为正常内皮细胞（NECs，ACKR1、CXCL12、POSTN、ENG 和 VWF）和肿瘤内皮细胞（TECs，PLVAP、SERPINE1 和 SPP1）。
9. 髓系细胞被注释为单核细胞（S100A8 和 S100A9）、SPP1+ 巨噬细胞（SPP1 和 C1QC）、LYVE1+ 巨噬细胞（LYVE1、C1QA 和 C1QB）、树突状细胞（CD1C、FCER1A 和 JCHAIN）和肥大细胞（MS4A2、KIT 和 CPA3）。

Identification of field of views and analysis of cell density

视野识别与细胞密度分析

Para_01

1. 总共识别出了127个分期的视野（FOVs），包括45个NOR、25个LGIN、21个HGIN和36个ESCC视野（图S1）。
2. 在127个视野中，我们识别了各个阶段的不同细胞群体，包括NOR阶段的总计1,753,903个细胞，LGIN阶段的970,438个细胞，HGIN阶段的1,217,290个细胞以及ESCC阶段的2,500,375个细胞。
3. 以S1-1载玻片为例（图S1），22,344 × 5,440 μm²的载玻片提供了对同一患者连续轨迹的全面检查，涵盖了4种主要疾病状态。
4. 具体而言，这一轨迹跨越了4个视野，首先是正常的上皮区域（视野1，29,787个细胞，1,930 × 4,659 μm²），接着是两个癌前阶段的LGIN（视野2，21,744个细胞，1,430 × 4,432 μm²）和HGIN（视野3，177,547个细胞，11,201 × 5,433 μm²），最后到达ESCC（视野4，165,435个细胞，7,783 × 5,255 μm²）。

Para_02

1. 对于每个视野，根据它们的空间坐标将斑点分配到 100 μm × 100 μm 的网格中。
2. 细胞密度通过计算单位面积内的目标细胞数量来确定，具体是每 10,000 μm²。
3. 具体来说，由于上皮细胞和成纤维细胞分布在整个上皮和间质区域，并且细胞密度取决于视野内捕获的细胞数量，因此我们没有计算它们的密度，而仅比较了间质和免疫细胞类型的密度。

Calculation of relative distances of epithelial cells and intercellular distances

上皮细胞的相对距离和细胞间距离的计算

Para_01

1. α-形状方法被用来量化上皮距离和厚度。简而言之，NOR和LGIN阶段的上皮以及HGIN阶段的非侵袭区域使用了一个凸包多边形来近似，该多边形由食管腔（上边界）和上皮间质界面（下边界）定义。
2. 考虑到HGIN阶段的侵袭区域，下边界根据邻近的非侵袭上皮区域来确定，以便更好地表征空间特征。
3. 包含至少两个不同阶段的样本被纳入此计算。

Para_02

1. 凸多边形覆盖上皮区域是由使用alphahull包（版本2.5.0）中的α-形状函数手动输入边缘点坐标生成的。
2. 对于相应阶段的每个上皮细胞，计算了到上边界和下边界的最短欧几里得距离（表示为上部和基底距离）。
3. 上皮厚度通过以下两种方法之一进行估算：（1）在NOR和LGIN阶段以及HGIN阶段的非侵入性区域的上皮细胞中，将基底和上部距离之和作为厚度；或（2）在HGIN阶段的侵入性区域的上皮细胞中，将基底和上部距离之差作为厚度。

Para_03

1. 对于每个视野，确定每种子表皮细胞群体的相对距离的四分位距（IQR）。然后将比例厚度计算为每种子表皮细胞群体的IQR占该视野所有子群体总厚度的比例。

Para_04

1. 为了评估细胞间的空间相互作用，通过计算上皮细胞与成纤维细胞之间到对方群体中最近的10个相邻细胞的平均距离来测量细胞间距离，并反之亦然。亚群之间的距离通过平均每个细胞的个体距离来确定。

Distance-based pathway enrichment and gene set variation analysis

基于距离的通路富集和基因集变异分析

Para_01

1. 我们主要对来自MSigDB数据库（版本6.2）中描述的选定的Hallmark通路进行了通路富集分析。31,32,33
2. 为了将通路活性估计分配给单个细胞，我们使用标准设置应用了基因集变异分析（GSVA），如GSVA包83（版本1.34.0）中实现的那样。
3. 为了探索上皮细胞相对于CAF临近程度的通路活性变化，我们定义了上皮程序评分，即根据每个上皮细胞对应通路的功能计算的基因平均表达量（表S2），并通过距离CAF的距离对其进行了平均。
4. 这些上皮程序评分通过距离CAF的距离进行平均处理。

Construction of invasiveness and dedifferentiation scores

侵袭性和去分化评分的构建

Para_01

1. 上皮侵袭性评分基于19种侵袭性细胞标记基因的平均表达水平，包括JAG1、NOTCH1、ITGA6、COL17A1、CDHR1、EPCAM、FN1、TAGLN、ZEB2、CXCL12、MMP2、NFE2L2、SOX2、TP63、RUNX1、TP73、SPP1、VEGFA和VEGFC。
2. 对于去分化评分，我们之前建立并验证了一个模型，用于从单细胞scRNA-Seq数据估算人类食道的去分化水平。
3. 该模型基于估计43种食道特异性转录因子（TFs）的分化活性，这通过测量它们调控基因的表达来实现（每个TF对应一个调控基因集）。
4. 然而，大多数这些调控基因不在Xenium In Situ平台上，这阻碍了这种方法直接应用于估算单细胞的去分化。
5. 为了解决这一挑战，我们开发了一种随机森林（RF）机器学习算法，使用来自Human Cell Atlas项目的80,489个正常食道上皮细胞的scRNA-seq数据，来预测食道上皮内的分化水平。
6. 分析限制在Xenium In Situ平台上存在的300个基因上。
7. RF预测器使用定量的分化度量进行训练，由43种食道特异性转录因子的平均转录因子分化活性（avTFA）给出。
8. avTFA代表了根据我们先前研究定义的43种食道特异性转录因子的平均分化活性。
9. RF预测器的训练数据集包含40,244个细胞，而模型选择则使用独立的20,122个细胞的数据集。
10. 更详细地说，我们使用训练数据集来学习许多不同的RF预测器，每个预测器由不同数量的树参数化，树的数量从10到200不等，每次增加10。
11. 然后使用模型选择集来选择具有最佳泛化性能的RF预测器（由树的数量指定），在分离的Pearson相关系数和均方根误差指标下评估。
12. 一旦树的数量大约为100，泛化性能显示出了一个平台期，因此我们认为100棵树的模型是"最优"的。
13. 对该选定的RF预测器（及其分化评分）的验证是在HCA数据的剩余20,123个独立细胞上进行的。
14. 进一步的独立验证是通过使用来自GTEx联盟的正常食道的snRNA-Seq数据完成的，获得了0.94的相关系数。
15. 当将最优的100棵树的RF预测器应用于多阶段ESCC样本的scRNA-Seq和Xenium In Situ数据时，我们对预测的分化评分进行了线性变换，以便该评分可以解释为去分化评分。
16. 具体而言，如果minS和maxS分别表示给定数据集上获得的最小和最大分化评分，则定义去分化评分为：去分化评分 = (maxS - RF-DiffID分数) / (maxS - minS)，这确保了当分化评分最大时去分化评分为0，当分化评分最小时去分化评分为1。

Analysis of the effect of Notch1 knockout on ESCC development in mice

Notch1敲除对小鼠食管鳞状细胞癌发展影响的分析

Para_01

1. Notch1+/+、Notch1+/−和Notch1−/−成年小鼠（实验开始时8周龄，共45只）接受了含有4-NQO（100 μg/ml，N8141，Sigma-Aldrich）的饮用水处理16周，以诱导多阶段食管鳞状细胞癌的发生，如Yao等所述86。
2. 在16周4-NQO处理后，饮用水被无菌水替换，直到小鼠在4-NQO处理后18、22和26周时被安乐死，如86、87、88所述。

Para_02

1. 小鼠食道被采集后，用微小的针固定成卷（食道瑞士卷）并用4%的多聚甲醛固定和石蜡包埋（FFPE）。
2. FFPE组织块被切成10微米厚的切片，随后进行苏木精和伊红染色。
3. 使用NanoZoomer S60数字切片扫描仪（C13210-01，滨松）在物镜2.5倍下对切片进行了扫描。
4. 组织病理学特征如先前所述进行了识别。12,80
5. 图像进一步使用100微米 x 100微米的网格划分。
6. 每个卷的量化计算是通过将LGIN/HGIN/ESCC病变区域面积除以小鼠食道总面积来完成的。

Cellular neighborhood identification

细胞邻域识别

Para_01

1. 对于这些组织中的每个细胞，定义了一个细胞邻域作为给定半径内的细胞集合。
2. 使用X/Y坐标之间的欧几里得距离来描述细胞距离。
3. 随后根据它们相对于10种细胞类型或19种子细胞类型的组成对这些邻域进行聚类。
4. 最终使用无监督K均值聚类方法，这些邻域被聚类成11个细胞邻域簇，如图4F和S4E所示。
5. 具体来说，每个邻域被转换成一个长度为10的向量，该向量包含邻域内每种细胞类型的频率，然后使用R语言（版本4.3.1）中的stats包的kmeans函数对这些向量进行聚类。

Cell-cell communication analysis

细胞间通讯分析

Para_01

1. 细胞间通讯分析主要使用CellChat（版本2.1.2）来检查食管鳞状细胞癌阶段上皮细胞与成纤维细胞之间的通讯模式。
2. 所有的预处理步骤都是按照软件包的默认参数进行的。
3. 我们进一步实施了LIANA+框架来解码成纤维细胞和髓系细胞之间的细胞串扰。
4. 此分析整合了CellPhoneDB的配体受体推断方法和Omnipath的综合配体受体相互作用数据库。

Co-culture, migration, and invasion assays

共培养、迁移和侵袭实验

Para_01

1. 我们使用带有0.4 μm孔径的Corning品牌6孔和12孔Transwell插件进行了成纤维细胞与食管癌细胞系的共培养测定。
2. Het1A和KYSE510细胞被接种在下室，而NFs或CAFs则接种在上室，上皮-成纤维细胞的比例为1:1。
3. 通过带有8 μm孔径的Corning品牌24孔Transwell插件评估了NFs或CAFs的迁移能力。
4. 在含有1%胎牛血清(FBS)的培养基中，将NFs或CAFs(5 × 10^4)接种在上室，并将KYSE510细胞的条件培养基作为趋化因子，置于下室。
5. 孵育18-20小时后，用100%甲醇固定NFs或CAFs，并用0.5%结晶紫溶液染色。
6. 通过类似的方法，使用Matrigel包被的方式对小鼠类器官来源的细胞（Het1A和KYSE510细胞）进行了侵袭测定。
7. 在显微镜下对膜底部的细胞进行计数，在每组中随机选择三个非重叠视野进行计数。

Quantitative real-time PCR analysis

实时定量PCR分析

Para_01

1. 总RNA从小鼠类器官、Het1A和KYSE510细胞中提取，使用了RNA-Quick纯化试剂盒（ES Science）。
2. 通过使用PrimeScript™ RT Master Mix（Takara）进行了逆转录。
3. 使用TB Green Premix Ex Taq™ II（Takara）在ABI QuantStudio 5实时PCR系统上定量mRNA水平。
4. 用于qRT-PCR的引物序列列于表S3。
5. 各个mRNA表达水平以GAPDH RNA水平进行标准化。

Western blot assays

西方免疫印迹实验

Para_01

1. 总蛋白从细胞裂解物中提取。使用BCA试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确定蛋白质水平。
2. 含有10-20微克蛋白质的裂解物通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜（Millipore）上。
3. 然后，膜在4°C下与初级抗体一起孵育过夜，再与二级抗体一起孵育2小时，随后使用SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物（Thermo Fisher）在Amersham Imager 600中可视化。
4. 针对JAG1（70109），FAP（66562），胶原I（72026），NICD1（4147）或HES1（11988），波形蛋白（5741），vinculin（4650）和GAPDH（2118）的抗体来自Cell Signaling Technology；针对α平滑肌肌动蛋白（ab124964），CCL20（ab9829）或IL6（ab233706）的抗体购自Abcam；针对CXCL1（12335-1-AP），CXCL8（27095-1-AP）或α-微管蛋白（11224-1-AP）的抗体购自Proteintech。

Chromatin immunoprecipitation coupled quantitative polymerase chain reaction assays

染色质免疫沉淀结合定量聚合酶链反应检测

Para_01

1. 我们使用SimpleChIP® Plus超声染色质免疫沉淀试剂盒（56383，Cell Signaling Technology）进行了染色质免疫沉淀（ChIP）实验。
2. KYSE510细胞用甲醛进行交联处理（最终浓度1%）10分钟，然后在室温下用甘氨酸孵育5分钟。
3. 细胞被收集并重新悬浮在细胞裂解液和核裂解液中。
4. 染色质使用Covaris S220聚焦超声仪在4°C下超声处理10分钟（峰值入射功率：140瓦，占空比：5%，每个脉冲周期：200次）进行片段化。
5. 片段化后，染色质在4°C下与CSL抗体（5313，Cell Signaling Technology）或IgG（56383，Cell Signaling Technology）旋转孵育过夜。
6. 使用ChIP DNA Clean & Concentrator（D5201，ZYMO RESEARCH）纯化的DNA片段通过qPCR进行分析，引物见表S3。

Immunoprecipitation assays

免疫沉淀实验

Para_01

1. 长至90%汇合度在15厘米培养皿中，带有或不带有JAG1过表达的KYSE510细胞使用弱RIPA裂解缓冲液（碧云天）和蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（NCM生物技术）收获以提取蛋白质。
2. 通过BCA试剂盒（赛默飞世尔科技）确定细胞裂解物中的总蛋白水平。
3. 等量的蛋白质使用NICD1（4147S，Cell Signaling Technology）或CSL（30044-1-AP，Proteintech）进行免疫沉淀，使用Pierce™经典磁性免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒（英潍捷基）。
4. 并将洗脱产物上载到Western印迹中。

Multiplex immunofluorescence analysis

多光谱免疫荧光分析

Para_01

1. 石蜡包埋的多阶段小鼠、人食管组织切片，以及LUSC和CESC（ZL-LUC1603、ZL-UtrSur1601、韦傲生物技术有限公司，中国上海）和HNSC（HN1170c01、中科光华智能生物技术有限公司，中国西安）组织芯片，根据制造商的说明使用PANO 7-重叠IHC试剂盒（0004100100、PANOVUE）进行了多重免疫荧光染色，如陈等所述。14
2. 人或小鼠组织切片用针对MMP2（40994、Cell Signaling Technology）、MMP11（30615-1-AP、Proteintech）、PANCK（ab7753、Abcam）、VEGFA（19003-1-AP、Proteintech）、VEGFC（22601-1-AP、Proteintech）、JAG1（ab7771、Abcam）、NICD1（4380、Cell Signaling Technology）、FAP（66562、Cell Signaling Technology）、αSMA（19245、Cell Signaling Technology；ab124964、Abcam）、CXCL1（12335-1-AP、Proteintech）、EPCAM（21050-1-AP、Proteintech）、I型胶原蛋白（14695-1-AP、Proteintech）和III型胶原蛋白（22734-1-AP、Proteintech）的一级抗体进行染色。
3. 载玻片用DAPI复染以可视化细胞核，并随后使用VectaShield HardSet封片介质进行封片。
4. 使用NanoZoomer S60数字切片扫描仪（C13210-01、滨松）通过×10、×20或×40物镜获取并可视化免疫荧光图像，遵循制造商的说明。
5. 使用ImageJ分析软件进行荧光强度分析。

Survival analysis

生存分析

Para_01

1. Bulk RNA-seq数据来自Chang等人的研究、Zhang等人的研究、Li等人的研究以及TCGA数据库，用于评估"CAF-Epi-免疫"评分的预后性能。
2. 基于不同细胞类型的标记基因，使用Cox比例风险回归模型计算了不同细胞类型的HR。
3. 总共将36个基因（侵袭性评分：JAG1、NOTCH1、ITGA6、COL17A1、CDHR1、EPCAM、FN1、TAGLN、ZEB2、CXCL12、MMP2、NFE2L2、SOX2、TP63、RUNX1、TP73、SPP1、VEGFA和VEGFC；CAF评分：FAP、MMP1、MMP11、POSTN、COL1A1、COL1A2和COL3A1；CD8+ Tex：PDCD1、CXCL13和CTLA4；SPP1+巨噬细胞：SPP1、APOE、APOC1和ACP5；CD4+ Treg：TNFRSF9和BATF；CD4+ Tfh：CD200和TOX）拟合到LASSO Cox回归模型中，构建了一个增殖-CAF风险评分。
4. 在模型构建之后，基于26个基因的"CAF-Epi-免疫"评分（侵袭性评分：JAG1、NOTCH1、ITGA6、COL17A1、FN1、ZEB2、CXCL12、MMP2、SOX2、TP63、TP73和SPP1；CAF评分：MMP1、MMP11、POSTN、COL1A1、COL1A2和COL3A1；CD8+ Tex：PDCD1、CXCL13和CTLA4；SPP1+巨噬细胞：SPP1、APOE和APOC1；CD4+ Treg：TNFRSF9和BATF；CD4+ Tfh：TOX）被建立来根据中位数评分将患者分为高风险组和低风险组。
5. 生存曲线使用Kaplan-Meier方法测量，P值通过log-rank检验计算。
6. 生存分析由survival包（版本3.6-4）进行。

Para_02

1. 我们构建了5个模型进行分析：模型1基于侵袭性评分的Cox回归；模型2基于CAF评分；模型3结合了侵袭性和CAF评分；模型4在模型3的基础上加入了免疫评分；模型5基于TNM分期。
2. 我们使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）和曲线下面积（AUC值）来评估模型强度。
3. 对于'CAF-Epi-Immune'评分，我们还进行了似然比检验，比较了包含'CAF-Epi-Immune'评分和TNM分期的模型与仅含TNM分期的模型。
4. R包pROC（版本1.18.5）用于生成ROC曲线并计算相应的AUC值。

Statistical analysis

统计分析

Para_01

1. 我们使用 R 4.3.1 和 Python 3.10.9 进行了统计分析。
2. 统计细节的描述见图注、正文和方法部分。
3. P 值是通过双侧和独立样本的 Wilcoxon 秩和检验、独立样本 t 检验或 Kruskal-Wallis 检验后进行 Dunn 事后检验计算得出的。
4. 实验中的误差线表示至少三个独立实验的平均标准误（S.E.M.）。

Supplemental information